WB的无敌战神之路 —— 一抗孵育
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发布时间：2024-09-17 21:36
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时间：2024-09-20 21:51
WB实验的旅程，导师与学员共成长。初入实验室，新手面对WB就像闯入雷区，一不小心便可能遭遇“落地成盒”的尴尬。为助大家迅速掌握制胜秘籍，提升实验技巧，本文系列《WB实验全攻略》应运而生，旨在引领各位迅速成长为实验室的MVP，进阶成为WB领域的无敌战神。
上期我们讨论了如何“封闭”实验，本篇将聚焦于WB中最为核心的一环——一抗孵育。一抗，是实验的灵魂，如何选择与使用它，将直接影响实验的成败。以下是抗体选购与使用的关键步骤：
首先，明确目标：在目标抗体的购买网站，输入靶蛋白的名称，比如GAPDH，以确保找到精准的抗体。
其次，确认验证：通过Uniprot号进行确认，确保所选抗体适用于实验需求，避免因重名而误选。
再次，审视特性：确认抗体能否识别目标蛋白的翻译后修饰，如乙酰化或磷酸化，以及蛋白的剪切体形式。同时，考虑是否需要识别蛋白家族中的多个成员。
接着，关注物种适应性：选择与实验样本同种属或不同种属的一抗，以减少非特异性结合和交叉反应的风险。
然后，单抗或多抗选择：单抗特异性高，批次差异小；多抗覆盖更广，但批次差异可能大。选择时应结合物种的常见性与实验需求。
一抗孵育的原理与流程如下：一抗与靶蛋白特异性结合，通过孵育进行定性和半定量分析。具体步骤包括高倍稀释一抗，确保均匀覆盖膜面，通常室温孵育1.5-2小时或在4°C过夜。清洗步骤是去除未结合的抗体，通常使用PBST或TBST，清洗次数和时间需根据实验需求调整。
在实验中，若遇到条带缺失、背景脏或非特异性条带、信号弱以及条带反白等问题，可考虑调整孵育条件、优化抗体浓度、提高稀释比、增加清洗次数等措施。注意，抗体的储存与使用需遵循说明书指导，避免回收使用，以保证实验结果的准确性和可靠性。
