酶的活性1比1000是多少U啊(酶是粉末状的)
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发布时间：2022-04-23 09:37
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时间：2023-10-09 17:12
下面的实验五可以：其余的可能对你也有用，遂没删
实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取
一、原理与目的
多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、材料与试剂
（1）马铃薯（大约每小组100-200g）
（2）试剂：
0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置时配
（3）实验器械与仪器设备：
试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；
过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；
DL-7A大容量低速冷冻离心机
三、操作步骤
1：粗酶提取：
水果肉组织按1：1（W/V）比例与003M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
2：盐析分级沉淀：
在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。
四、实验结果
获得PPO粗酶液。
实验二 PPO粗酶液的纯化
一、原理
1.葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析利用大分子不能进入凝胶颗粒内部最先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而最后流出柱外，凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。（G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质）
2.利用离子交换法，选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料，因为PPO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO，（NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来）。粗酶液从而得到纯化。
二、材料与试剂
试剂：0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纤维素DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200;兰葡萄糖－40、70、100等；
实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机
三、操作步骤
1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡
（1）柱材处理
称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
（2）装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶
