四毒清减轻内毒素性肝损伤的机制研究

・实验研究・

陕西中医2005年第26卷第4期

四毒清减轻内毒素性肝损伤的机制研究

彭雪梅　暨南大学附属第一医院麻醉科(510630)

王华东　陆大祥　王彦平　戚仁斌　付咏梅　李楚杰　暨南大学医学院病理生理教研室3(510630)

　　摘　要　目的:观察四毒清对内毒素性肝损伤的影响及作用机制。方法:配制中药复方

四毒清(SDQ)为1g󰃗内毒素组、mL生药,小鼠随机分4组:对照组、SDQ组、SDQ防治组。用H2O或SDQ灌胃,3d后腹腔注射LPS或生理盐水。腹腔内注射不同时间后,观察小鼠血清ALT的活性、肝组织匀浆中TNF2Α的含量、MDA的含量及SOD的活性,且观察各组小鼠肝脏组织病理变化。结果:腹腔

、LPS注射后小鼠血清ALT活性及肝组织中TNF2ΑMDA的含量明显高于对照组;SDQ防治组小鼠血清ALT活性及肝组织中TNF2Α、MDA的含量明显

低于内毒素组,肝组织中SOD活性明显高于内毒素组。组织学发现SDQ防治组小鼠肝脏的病理明显减轻。结论:中药复方SDQ对肝脏具有一定的保护作用,其机制与其抑制TNF2Α和氧自由基生成有关。

　　主题词　肝损伤󰃗中医药疗法　@四毒清󰃗药效学　丙二醛󰃗代谢　超氧化合物岐化酶󰃗

代谢　丙氨酸转氨酶󰃗代谢　小鼠

　　内毒素性休克及继发的多脏器功能衰竭的治疗是医学界的一大难题,肝脏在多脏器功能不全综合症(MODS)的发生中起着重要作用。在我们前期的研究中发现中药复方四毒清能显著降低LPS攻击小鼠的死亡率,防治

LPS性多器官功能衰竭1。本研究在此基础上进一步观

OLYMPUSBX40;电子显微镜,PHILIPSTECNAI210TEM。

1.5　统计学处理　所有计量资料用均数±标准差

θ±s)表示,用SPSS10.0统计软件包进行分析,组间两(x

两比较用单因素方差分析。取Α=0.05为显著性水准,判断各组间差异是否具有显著性。

2　方　法　2.1　分组　健康雄性昆明小鼠,合格

察中药复方四毒清防治LPS性肝损伤的作用效果,并探讨其防治内毒素性肝损伤的作用机制。

1　材　料　1.1　中药的配制:中药四毒清复方由

证号2001B023,体重18～22g。实验室温度控制在(24±

1)℃,相对湿度为40%～80%。分组:将健康小鼠在实验

黄连、黄芩、赤芍、白薇、枳实、柴胡、三七等七味中药制成,以上中药购自广州华侨医院药材科。上述中药加水浸泡30min,分2次煎制,最后浓缩,三七粉后加混匀,配成每1mL药液含1g生药。

1.

2　内毒素的配制:大肠杆菌脂多糖(LPS)由

sigma公司提供,型号为O55:B5,每只动物腹腔内注射0.2mL󰃗10g。

1.3　试剂盒:超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒及

室适应3d后随机分4组,(1)对照组(胃内灌注H20+腹

(2)内毒素组(胃内灌注H20+腹腔注腔注射生理盐水)、

(3)四毒清组(胃内灌注四毒清+腹腔内注射生射LPS)、

理盐水)和(4)四毒清防治组(胃内灌注四毒清+腹腔内注射LPS)。①正常对照组、10gH2O内毒素组用0.2mL󰃗灌胃,连续3d,每天2次,每次灌注时间间隔12h,在第3d灌胃2h后,分别在腹腔内注射(ip)1次0.9%生理盐水

(0.2mL󰃗10g)和LPS(0.2mL󰃗10g,30mg󰃗kg),2h后再

丙二醛(MDA)测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所

)ELISA试剂盒由美国提供;肿瘤坏死因子2Α(TNF2Α

用H2O(0.2mL󰃗10g)灌胃1次;②四毒清组、四毒清防治组均用中药复方四毒清0.2mL󰃗10g灌胃,连续3d,每天

2次,每次灌注时间间隔12h,在第3d灌胃2h后分别在腹10g)和LPS(0.2腔内注射(ip)1次0.9%NS(0.2mL󰃗

10g,30mg󰃗mL󰃗kg),2h后再用中药复方四毒清(0.2mL󰃗10g)灌胃1次。

2.2　观察指标　2.1.1　各组小鼠血清ALT活性、

2RΑDsystems公司提供。

1.4　实验仪器:酶标仪由BIO2RAD公司提供(microplatereader),仪器型号为Model2550;BECKMANCX7DELTA全自动多功能生化仪;光学显微镜,

基金项目:广东省自然科学基金资助项目(31879)3国家中医药管理局三级科研实验室

肝脏组织匀浆中SOD活性、MDA及TNF2Α含量:按上述

陕西中医2005年第26卷第4期

方法复制动物模型,10h后,血清检测ALT活性。称取

100mg左右肝组织,测定肝脏SOD活性和MDA的含

量。另2h后,采用酶联免疫吸附分析方法测定TNF2Α的含量。

2.2.2　各组小鼠肝脏组织结构和超微结构变化:按

上述方法制作动物模型,24h后,取肝脏组织,行HE染色;同时取肝脏标本,做电镜观察肝脏组织超微结构。

3　结　果　3.1各组小鼠血清ALT活性的影响:

表1　各组小鼠血清ALT活性的改变(θx

±s)分组例数

ALT(U󰃗L)对照组

1043.9±8.1四毒清组1145.4±9.4#

内毒素组1171.6±29.2

☆

四毒清防治组

10

52.9±14.3

#★

　　☆P<0.01,#P>0.05与对照组比较;★P<0.

05与内毒素组比较

表1显示,LPS组小鼠血清ALT活性明显高于对照组,四毒清组小鼠ALT活性与对照组无明显差别,四毒清防治组小鼠的血清ALT活性明显低于内毒素组(P<

0.05)。

3.2　各组小鼠肝脏组织形态学变化　光镜下(封三

图1),对照组和四毒清组小鼠的肝脏组织未见明显的病理变化;内毒素组肝小叶失去正常结构,肝板排列紊乱,肝窦淤血、肝细胞水肿、变性;四毒清防治组与内毒素组比较,淤血不明显,肝细胞变性较轻。电镜下(封三图2):对照组和四毒清组小鼠肝细胞正常,核膜清楚、染色质稀疏,胞浆内有大量线粒体、粗面内质网。LPS组,肝细胞胞浆内出现大量空泡,细胞核核膜断裂、染色质着边,部分细胞线粒体肿胀、外膜结构模糊;四毒清防治组,肝细胞胞浆中出现颗粒状物质,线粒体轻度肿胀、外膜清楚,细胞核核膜清楚。

3.3各组小鼠肝脏组织中MDA含量的影响:

表2　各组小鼠肝脏组织中MDA含量变化(θx

±s)组别例数MDA(nmol󰃗mgprotein)

对照组

103.2±1.2四毒清组111.9±0.9#

内毒素组116.4±1.4

☆

四毒清防治组

10

3.4±1.3

★#

　　☆P<0.01,#P>0.05与对照组比较;★P<0.

05与内毒素组比较

表2所示,LPS组小鼠肝脏组织中MDA含量明显高于对照组,四毒清小鼠肝脏组织中MDA含量与对照组无显著差异,四毒清防治组的肝脏组织中MDA含量明显低于内毒素组。

3.4　各组小鼠肝脏组织中SOD活性的变化

369

表3各组小鼠肝脏组织中SOD活性

变化(θx

±s)组别例数

SOD(U󰃗mgprotein)

对照组

1011.4±2.8四毒清组117.66±3.1#内毒素组113.6±1.1☆四毒清防治组

10

7.8±3.2★#

　　☆P<0.01,#P>0.05与对照组比较;★P<0.

05与内毒素组比较

表3所示,LPS组小鼠肝脏组织中SOD活性明显低于对照组,四毒清组小鼠肝脏组织中SOD活性与对照组无明显差别,四毒清防治组的肝脏组织中SOD活性明显高于内毒素组(P<0.05)。

3.5　各组小鼠肝脏TNF-Α含量的影响

表4　各组小鼠肝脏组织中TNF-Α含量

变化(θx

±s)组别例数TNF-Α(pg󰃗mgtissue)

对照组

10-四毒清组11-内毒素组11290.19±142.2四毒清防治组10

184.32±66.3★

　　★P<0.05与内毒素组比较.-代表TNF2Α未检

测出

表4所示,LPS组小鼠肝脏组织中TNF2Α含量明显高于四毒清防治组,用ELISA法未能测出对照组和四毒清组小鼠肝脏组织TNF2Α的含量。

4　讨　论　近几年来,内毒素血症与肝损伤的关系

日益受到重视2、3、4

,本实验拟探讨中药复方四毒清对急

性肝损伤的防治作用及其作用机制。

4.1　中药复方四毒清对TNF2Α的影响　本实验通

过检测肝组织匀浆液中TNF2Α含量,发现在小鼠腹腔内注射内毒素后,其肝组织匀浆液中TNF2Α浓度明显升高,进一步说明肝脏组织中TNF2Α合成增多可能是内毒素性肝损伤的重要机制,应用四毒清能显著抑制内毒素引起的TNF2Α合成增加,且四毒清防治组小鼠肝脏淤血及病变等超微结构也减轻,四毒清组与对照组小鼠肝组织中未能检测到TNF2Α,表明四毒清抑制LPS引起的TNF2Α合成,改善肝脏微循环是该中药防治内毒素性肝损伤的重要机制之一。

4.2　中药复方四毒清对肝脏组织氧自由基生成的

影响　研究表明,自由基及其所引发的反应是造成内毒素血症早期肝细胞线粒体呼吸功能损伤的重要原因5。本实验通过直接检测肝组织匀浆液中MDA水平,发现在小鼠腹腔内注射LPS后,其肝组织匀浆中MDA浓度明显增高,说明在急性内毒素血症小鼠肝组织中氧自由基

370

生成量明显增加。本研究观察到四毒清能显著降低LPS攻击小鼠肝脏组织中MDA水平,说明清除自由基是四毒清减轻内毒素性肝损伤的重要机制。有研究表明肝细胞线粒体的损伤在其发病机制中的重要作用6。本研究发现四毒清能减轻LPS引起的线粒体损伤,提示保护线粒体功能,可能是该中药减少自由基生成的原因之一。此外,本实验四毒清防治组肝脏组织中SOD活性明显高于内毒素组,表明四毒清可以通过提高SOD的活性清除自由基。

一些中药有抗菌、拮抗和灭活内毒素的作用,可用于治疗内毒素血症7。正如四毒清由七味中药组成,此方具有清热解毒、理气活血的功效。本实验证实四毒清可以有效的减轻LPS性肝脏损伤,对肝脏具有一定的保护作用,其作用机制可能与其抑制肿瘤坏死因子-Α的释放、减少氧自由基的产生、增加氧自由基的清除、保护线粒体功能有关,为内毒素性肝损伤及脓毒血症的治疗提供了有价值的实验资料。

陕西中医2005年第26卷第4期

杂志,2004;20(2)∶219～223

2　马羽萍,彭杰,赵铃,等.中西医结合治疗重症型

肝炎和肝炎肝硬变合并内毒素血症40例.陕西中医,

2002;23(7)∶579～580

3　AdamsonGM,BillingsRE.

Tumornecrosis

factorinducedoxidativestressinisolatedmousehepatic

～223cytos[J.ArchBiochemBiophys,1992,294

4　王宇明,丁健,顾长海,等.内毒素󰃗肿瘤坏死因子

所致肝细胞损害机制的体外研究[J.中华传染病杂志,

1996;14(1)∶1～5

5　毕铭华,张淑文,王宝恩,等.内毒素血症对大鼠

肝细胞线粒体的损伤及其机制[J.中国应用生理学杂志,

2004;20(1)∶90～97

6　毕铭华,刘树森,等.大鼠内毒素血症早期肝细胞

线粒体的氧化损伤及中药912液的干预作用[J.中华急诊医学杂志,2001;10(2)∶79～81

7　郭峰坤.中西医结合治疗慢性肝病内毒素血症78

参考文献

1　王华东,杨静,陆大祥,等.四毒清对脂多糖攻击

例.陕西中医,2002;23(1)∶15～16

(收稿2004212210;修回2005201216)　　

小鼠多器官功能障碍和生存率的影响[J.中国病理生理

白蒺藜血清对酪氨酸酶活性的双向调节作用3

杨　柳　赖梅生　蔡红兵　南方医科大学中医系中医外科教研室(510515)

　　摘　要　目的:观察白蒺藜高、中、低三种给药剂量大鼠不灭活血清对酪氨酸酶(TYE)

活性的影响,以期指导临床用药。方法:重复测量设计,应用多巴氧化速率法

检测不同时间点5组不同大鼠血清对反应体系中吸光度值的变化(△OD)。结果:白蒺藜低剂量(10g)对TYE具有抑制作用,高剂量(30g)对TYE活性有激活作用(P<0.05);中剂量(20g)和补骨脂素对TYE的作用倾向于激活作用,与空白血清对照无统计学意义。结论:白蒺藜对酪氨酸酶活性的影响与大

鼠给药剂量有关,有低浓度抑制,高浓度激活的双向调节作用,临床应用白蒺藜治疗色素障碍性疾病时,除应辨证用药外,色素沉着性疾病宜用低浓度,色素脱失性疾病宜用较大剂量。

　　主题词　白蒺藜󰃗药效学　酪氨酸酶󰃗代谢　大鼠

　　白蒺藜(剌蒺藜)为一年或多年生草本植物蒺藜的果实。味苦、辛,性平,入肝经。含有多种生物碱和甙类,以及含有多种丰富的过氧化物分解酶,有明显抗衰老作用,可去除面上瘢痕,治疗白癜风。具有平肝疏肝,祛风清热美肤的功效。《本草纲目》曰:“洗面黑,祛斑,洗瘢疮。”临床基金项目:广东省中医药管理局科研基金资助课题(编号:103082)

上常用于治疗白癜风或黄褐斑等色素代谢障碍性疾病。现代医学研究认为,色素代谢障碍性疾病的发病机理主要是各种原因引起酪氨酸酶(TYE)活性的改变而导致表皮黑素含量的改变。在中医祛风疏肝理论的指导下将白蒺藜用于治疗现代医学认为发病机理完全相反的黄褐斑与白癜风,其根据是什么?如何把握?如何针对不同疾病做到合理用药?这是皮肤学科临床与研究都共同关注的问题。我们既往的研究观察到不同浓度白蒺藜水提物对