DNA连接反应的步骤及说明

克隆中两个重要步骤包括外源DNA与载体的连接和重组DNA的转化。连接反应是通过连接酶完成 的，连接反应需要ATP和镁离子催化双链DNA的

3’-OH和 5’-P形成磷酸二酯键。DNA末端可以是 粘末端，也可以是平末端。粘末端连接反应效率高于平末端连接效率。因此，在连接平末端分子时DNA 浓度要高于粘末端分子连接反应的DNA浓度。PEG可以使T4 DNA连接酶对平末端和粘末端连接效率 得到提高[Pheiffer, B.H., Zimmerman, S.B., Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871, 1983]。由于PEG可以辅助提 高连接效率，该试剂盒对于粘末端和平末端的连接只需十分钟即可完成。试剂盒中提供独特的5×Rapid Ligation Buffe，专为提高DNA连接效率设计。高的PEG浓度可以提高连接反应效率但却会使转化效率 降低，因此应该对PEG浓度进行优化。该试剂盒中优化的PEG浓度同时保证了高的连接效率和转化效率。 目录号 LINK-30 规格 30次 价格 180元 保存： 试剂盒中所有组分需-20℃保存。请不要用其它试剂替代该试剂盒中的反应缓冲液。

试剂盒包装组成：

该试剂盒中提供的试剂可以完成30×20μl DNA连接反应。

试剂盒组成 规格( 30 reactions )

T4 DNA ligase

30μl

5×Rapid Ligation Buffer

200μl

(5x RLB)

特点:

室温（20-25℃）连接10-30 min。 存储缓冲液：

10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM KCl

1 mM Dithiothreitol 50% Glycerol

质量控制：

试剂盒中提供的T4 DNA连接酶没有检测到外切核酸酶或内切核酸酶活性。另外每一批连接酶都通 过SDS聚丙烯酰胺凝胶检测蛋白污染（低于5%）。 ·核酸外切酶污染检验 T4 DNA连接酶与1mg经超声波处理的3H标记的E.coli DNA (105cpm/mg)在50ml反应体系中，采 用随酶提供的Rapid Ligation Buffer，

37℃温育4小时。通过三氯乙酸（TCA）沉淀DNA，然后计算上清 液的放射活性。通过计算上清液中被标记的总DNA放射活性，进而可以显示出核酸外切酶活性。检测出外切酶活性低于0.1放射活性，这种方法可检测出的底线是0.05%。 ·核酸内切酶检测 在50μl反应体系里，T4 DNA连接酶与1mg超螺旋质粒DNA 37℃温育4小时，用琼脂糖凝胶电泳 检测，只有<0.1%转变为缺口或线性质粒DNA。

操作步骤：

DNA片段克隆到质粒载体上

我们推荐载体与插入DNA的摩尔数比例为1:1或1:3。最佳的摩尔数比例因载体类型的不同而不同， 例如cDNA和基因组DNA克隆载体。可根据以下公式计算插入DNA用量：

[实例]:

载体与插入片段的摩尔数比例为1:3，如连接反应中加入100ng 6kb载体，插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为：

1.在一个PCR薄壁管中加入下列成份：

载体DNA 插入DNA 5×RLB T4DNA连接酶 ddH2O

2. 室温温育十分钟

3. 将连接反应液与感受态细胞做转化。(感受态效率：>1×107) 线性DNA重新环化：

在重新环化反应中DNA的量十分重要。同DNA片段克隆到载体相比，较低的DNA浓度有利于增强 重新环化，因为低的DNA浓度有利于分子内部的连接（重新环化），而抑制分子之间的连接。

100ng 25ng 4μl 1μl 至20μl

[实例]：

1.在一个PCR薄壁管中加入下列成份： 载体DNA 20~30ng 5×RLB T4 DNA连接酶 ddH2O

4μl 1μl 至20μl

2. 室温温育十分钟。

3. 将连接反应液与感受态细胞做转化。 (感受态效率：>1×107) 接头连接反应：

接头（8 个碱基或者更长）连接反应条件同 DNA片段与质粒载体连接相同。但是如果接头的长 度小于8个碱基或者GC含量较低，那么连接反应 应该在16℃进行 30分钟到2小时。我们推荐载体/ 接头摩尔比为： 脱磷酸化载体：磷酸化接头＞1:100 [实例]：

1. 在一个PCR薄壁管中加入下列成份：

DNA片段 接头 5×RLB T4 DNA连接酶 ddH2O

2. 16℃温育1小时

3. 将连接反应液与感受态细胞做转化。 （感受态效率：>1×107）

在接头连接反应中70℃十分钟可以使T4 DNA连 接酶失活，可根据试验情况进行纯化。

问题与建议：

影响连接反应的因素很多，例如：连接反应本身、感受态细胞、媒介选择、限制性内切酶对载体的消化能力、磷酸酶与载体的相互作用等。由于连接反应中的组 分对感受态细胞的抑制作用，因此在做转化之前应该对反应稀释5倍。下表列出了一些可能引起连接失败的原因及建议。

可能原因 在DNA中存在连接酶抑制物 DNA连接酶失活 建议解决方法 纯化DNA，用酚抽提并且乙醇沉淀 更换新的T4 DNA连接酶 100ng 25ng 4μl 1μl 至20μl

反应缓冲液中ATP降解 限制性内切酶的存在导致连接产物被再次消化 反应物中DNA被非特异性核酸内切酶降解 实验信息: 1.连接效率

粘末端DNA连接反应（EcoR I）

请于24个月内使用5×Rapid Ligation Buffer并于-20℃储存 通过酚抽提并且乙醇沉淀去除限制性内切酶或者热失活内切酶 尽量使用新的试剂，水要高压灭菌 平末端DNA连接反应（Sma I）

图1，以上两图为A公司的快速DNA连接试剂盒与SBS Genetech 快速DNA连接试剂盒的试验对比。无论粘末端还是平末端SBS Genetech试剂盒的连接效率均大于A公司。 2.长插入片断的连接

对于长度为1~2kb的插入片段，我们推荐在室温（20-25℃）下做连接，连接反应不超过 30分钟。虽然长片段（3kb）克隆效率要比短片段低，但仍可通过使用我公司该试剂盒完成，在使用我公司的快速DNA连接试剂盒时我们推荐DNA片段 100-300ng并延长连接反应时间，温育时间达到2小时有助于提高反应 效率。但是不推荐过夜连接，因为过夜连接对转化会有影响（降低转化效率）。