琼脂糖凝胶电泳常见问题分析

问题 DNA Marker降解 核酸酶污染 可能原因 解决方法 每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4°C保存 保存不当 4°C 或-20°C保存，避免多次反复冻融；不可加热 DNA Marker无法正确分离 条带黯淡 琼脂糖质量差 电泳缓冲液多次使用后失效 核酸浓度过低 核酸降解 DNA条带被示踪染料掩盖 使用质量可靠的琼脂糖制胶 更换缓冲液 增加上样量 使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料 条带模糊或弥散 电泳缓冲液多次使用后失效 核酸部分降解 核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 电压过低，电泳时间过长 根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳 染色时间过长或拍照前放置过久，DNA条带弥散 条带缺失 DNA条带分子量过大 分子量接近的DNA条带没有分开 电泳缓冲液使用不当 使用脉冲凝胶电泳 选择适当的凝胶浓度进行电泳 SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段 电泳时间过长或电压过高，DNA走出凝胶 电极插反，DNA走出凝胶 条带大小不正确 核酸降解或形成聚合物 正确连接电极方向 加热处理或重新制备样品 缩短电泳时间，调整电压 电泳结束后及时观察、拍照 更换缓冲液 使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 λ DNA酶切Marker的cos位点复性 电泳前65°C加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样 相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率 判断DNA分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢 梳子变形，点样孔不在同一水平线上 使用完好的梳子制胶 带型异常 不同样本的上样条件不同 上样量过大或过小 选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近 选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部 核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 电泳缓冲液未完全浸没凝胶 上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶 电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性 凝胶中加入EB造成染色不均 凝胶中有气泡或污染物 根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳 加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色 使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡 点样孔质量差 小片段扩散,条带模糊,粗 酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 待凝胶完全凝聚后再取出梳子 比如观察100bp的小片段用2%凝胶跑电泳 错误选择了低浓度凝胶,观察大片段用低浓度凝胶,观察小片段要用高浓度 琼脂糖质量不好,质量不好的琼脂糖分离小片段容易扩散,即使是使用高浓度凝胶 选择了不合适的电泳缓冲液 换用质量好的琼脂糖 SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段

DNA凝胶电泳简介

一、实验原理

DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。

2、琼脂糖凝胶电泳 可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。

二、琼脂糖凝胶

琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。

表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围

琼脂糖/％ 0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0 标准 高强度 低熔点 低粘度低熔点 700bp～25kb 500bp～15kb 800bp～10kb 800bp～10kb 250bp～12kb 400bp～8kb 400bp～8kb 150bp～6kb 300bp～7kb 300bp~7kb 80bp~4kb 200bp~4kb 200bp~4kb 100bp~3kb 100bp~3kb 500bp~1kb 500bp~1kb 100bp~500bp 10bp～100bp

由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。

随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。

三、DNA电泳影响因素

DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。

1、DNA分子大小：DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。

2、DNA分子构型：对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。

3、不同的胶浓度：对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。

4、电场强度：电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。实验中要根据需要选择合适电压，如对于DNA大片段的分离可适当选择较低电压进行（在Southern杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。

5、溴化乙锭：简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。

6、电泳缓冲液：目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE，其组成及特点见表2。一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。

表2 常用DNA电泳缓冲液

四、DNA上样缓冲液

电泳中DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，主要作用如下：

1、螯合Mg，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/L的EDTA。 2、增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。

3、指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。

目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液，一般为10×上样缓冲液，DNA样品中仅需加入1/10的量即可，加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。

五、DNA上样量的控制

在分析性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/带即可观察到清晰结果，而对于珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可。而对于一定量的DNA，当电泳时采用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；而随着电泳时间的延长，由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅。

对于染色体DNA的酶切片段包含各种大小的条带，上样量即使超过10mg条带也不会托尾，而单一条带（>10 kb）当上样量超过200ng就有可能产生托尾现象。

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