维普资讯 http://www.cqvip.com 中国抗生素杂志２００２年ｌ１月第２７卷第１１期 ·６５１ · 文章编号：１００１—８６８９（２００２ｌ１１－０６５１—０２ 利福平诱导ｒｐｏＢ基因突变活化变青链霉菌６６合成放线紫红素 张琴 胡海峰 朱宝泉 龚炳永 越智幸三 （１上海医药工业研究院， 上海２０００４０； ２日本食品综合研究所， 筑波３０５—８６４２，日本） 摘要： 变青链霉菌拥有完整的放线紫红素生物合成基因簇，但它通常并不合成这一抗生素。引入特定 的ｒｐｏＢ基因，不仅产生了对利福平的抗性，同时活化了放线紫红素的合成，表明由该基因编码的ＲＮＡ聚合 酶Ｂ亚基因在抗生素的生物合成调控中起十分重要的作用。ＤＮＡ顺序分析揭示出在ｒｐｏＢ基因上的四种不 同突变类型，均不同程度地活化变青链霉菌合成放线紫红素，表明利福平具有与链霉素类似的功能，即活化或 加强链霉菌合成抗生素或酶的水平。 关键词：利福平；ｒｐｏＢ基因； ＲＮＡ聚合酶；抗性；突变 中图分类号：Ｑ３４４ １２。Ｒ９７８．１ 文献标识码：Ａ 临床上使用的抗生素主要来源于微生物的次级代 谢产物，而在微生物中，放线菌贡献最大…１，对放线菌 合成抗生素调控的研究有助于揭示抗生素生物合成调 控机理和开发新的菌株选育方法。尽管传统的随机突 变方法已经成功地应用于青霉素和四环素等生产菌株 Ｔａｂ．１ Ｓｔｍｉｎｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ 的优化（生产水平提高１０００倍以上），但这一方法存在 正向突变频率低、耗时和劳动强度大等缺点。基于生 物化学、生理学和分子遗传学等学科的发展，开发和应 用理性的突变筛选和基因重组改造微生物。随着核糖 体工程的研究和发展，又有抗生素的抗性突变诱导或 活化微生物次级代谢的方法，其中链霉素成为一个代 表陛的抗生素＿２ｊ。本课题主要考察安莎类抗生素利 福平通过诱导ｒｐｏＢ基因突变活化变青链霉菌合成放 线紫红素。 １材料与方法 ｒｉｆ，ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ 入２００ｔｄ的孢子液，装载１５０ｍｌ液体培养基，在３０℃的 旋转摇床（２００ｒ／ｍｉｎ）培养到指定时间。发酵液经调节 ｐＨ至８．０离心，测定上清液在６３３ｎｍ处的ＯＤ值（表 示放线紫红素的生产量）。最小抑菌浓度（ＭＩＣ）参考 先前报道的方法。 １．３ ＤＮＡ顺序分析 一１．１菌株和制备突变株 变青链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）６６及其利福 平抗性突变株（Ｔａｂ．１）。把变青链霉菌的孢子液均匀 地涂布于含有１００～２００ｔ￣ｇ／ｍｌ利福平的ＧＹＭ平板， ３０℃培养５～７ｄ，自发的抗性突变株出现。 １．２培养基和培养条件 个保守的ｒｐｏＢ基因片断（从核苷酸８００到 ＧＹＭ和Ｒ４培养基的组成见先前的报道［引。出 发菌株被接种于ＧＹＭ平板，在３０℃培养７－９ｄ，按照 １５００）顺序被分析，包括野生菌株和利福平抗性的突变 株。根据天蓝色链霉菌基因组顺序数据库提供的 ｒｐｏＢ基因序列，我们设计了特异性的引物：正向引物 Ｐ１（５ 一ＧＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧ．３ ）和反 先前报道的方法制备孢子液。孢子液的浓度控制在每 毫升１０ 个孢子左右。发酵条件为：５００ｍｌ摇瓶中加 收稿日期：２００１—０７．１１ 作者简介：张琴，女，生于１９６９年，学士，主要从事微生物新药筛选。本文参加第九次全国抗生素（微生物药物）学术会议交流。 维普资讯 http://www.cqvip.com ·６５２· 利福平诱导ｒｐｏＢ基因突变活化变青链霉菌６６合成放线紫红素 张琴等 向引物Ｐ２（５ 一ＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡＧＣＧ（ ＣＴｃＣ一３ ）。 ＰＣＲ反应条件为：首先在９６℃培养５ｍｉｎ，然后在９６℃ 培养３０ｓ、５５℃１２ｓ、７２℃３０ｓ循环３０次，最后在７２℃ 培养１０ｍｉｎ（Ｐｅｒｋｉｎ—Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）。使用Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ和双脱氧链中止程序直接测定ＰＣＲ产物ＤＮＡ顺 序，使用ＧＥＮＥＴＩＸ软件分析和比较ＤＮＡ顺序数据。 ２结果分析 ２．１筛选抗性突变株 在含有利福平的ＧＹＭ平板上筛选出利福平抗性 突变株，经随机挑取６０个菌落，转接于Ｒ４琼脂平板； 在３０℃培养６ｄ，其中６个突变株有明显的放线紫红素 合成，有效的突变频率为１０％。抗性水平分析表明，６ 个突变株均获得较高耐利福平的水平（增加３０到４０ 倍）（Ｔａｂ．２）。 Ｔａｂ．２ Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓ．１ｉｖｉｄａｎｓ ６６ ｒｐｏＢ ｇｅｎｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａ：Ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ ｒｐｏＢ ｇｅｎｅ； ｂ：Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ（ＮＤ）ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｒｐｏＢ ｇｅｎｅ； Ｃ：Ｈ：Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｙ：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｒ：Ａｒｇｉｎｉｎｅ； Ｃ：Ｃｙｓｔｅｉｎｅ；Ｄ：Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ； Ｖ：Ｖａｌｉｎｅ． ２．２ ＤＮＡ顺序分析 先前的大量研究表明＿４ Ｊ，大多数安莎类抗生素抗 性突变均出现在ｒｐｏＢ基因的几个保守区域。因此， 我们分析突变株和野生株的保守区域ＤＮＡ顺序，发 现４个突变株拥有一个点突变，２个突变株的突变可 能在别的基因或ｒｐｏＢ基因其他区域（Ｔａｂ．２）。 ２．３放线紫红素生产分析 我们使用Ｒ４平板和Ｒ４液体培养基分析６个突 变株和野生株合成放线紫红素水平，如Ｔａｂ．２所示， ＳＲ—ｌ、ＳＲ一４和ＳＲ一６突变株产生较多的放线紫红素， ０．８ ０．７ ０．６ ０．５ ０．４ ０．３ ０．２ ０．１ ０ Ｔ（ｈ） Ｆｉｇ．１ Ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓ．１ｉｚ＆ｔａｎｓ ６６ ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（￥６６）ａｎｄ ｉｔｓ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ｒｓｅｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ（ＳＲ一１，ＳＲ一４） １：￥６６：２：ＳＲ一１；３：ＳＲ一４ 其他三个突变株生产水平低。如Ｆｉｇ．１所示，ＳＲ一４合 成放线紫红素比ＳＲ一１早，但产量比ＳＲ一１低。这些结 果表明不同的突变产生不同的影响。 ３讨论 链霉素是第一个被发现的具有诱导抗生素的产生 菌过量合成其抗生素的氨基糖苷类抗生素，随后又发 现其他氨基糖苷类抗生素具有类似的功能，并具有与 链霉素不同的作用机理（尚未发表数据）。与这些抗生 素不同，利福平属于安莎类抗生素，作用于ＲＮＡ聚合 酶。本研究表明ｒｐｏＢ基因突变，导致了对利福平高 水平的抗性。由于生产放线菌紫红素的水平差异较 大，提示抗性水平与活化抗生素生产能力之间无直接 的关系。 参考文献 ［１］Ｈｕ Ｈ Ｆ，Ｚｈｕ Ｂ Ｑ，Ｇｏｎｇ Ｂ Ｙ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｓｕｂ ｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｎｅｗ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｎｏｔｅｓ ０” Ａｎｔｉｂｉｏｔ，１９９８；１９（６）：４０１ ［２］Ｓｈｉｍａ Ｊ，Ｈｅｓｋｅｔｈ Ａ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ｓ，ｅｔ口 ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉ ｎｏｒｈｏｄｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｐｓＬ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１２）ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｒｓｅｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐ— ｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）［Ｊ］．‘， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９６；１７８：７８７６ ［３］Ｈｕ Ｈ Ｆ，Ｏｅｈｉ Ｋ．Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｍｐｍｖｌｎｇ ｔｈｅ ｐｒｄｏｕｃ． ｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ—ｐｒｏｄｕｃｉｇｎ ｓｔｒａｉｓｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｒｓｅｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｐ／，ｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１；６７ （４）：１８８５ ｌ４］ＪｉｎＤ Ｊ，ＧｒｏｓｓＣＡ．Ｍａｐｐｉｇｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｇｎ ｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｌｗｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｐｏＢ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｌｅａｄ ｔｏ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ｒｅｓｉｓ． ｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，１９８８；２０２：４５ ［５］ＨｏｐｗｏｏｄＤＡ，ＢｉｂｂＭ Ｊ，ＣｈａｔｅｒＫＦ．ｅｔａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｎａｎｉｐ ｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｒｎｙｃｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ［Ｍ］．Ｎｏｒｗｉｃｈ： Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄｑｔｉｏｎ，１９８５：２０１ （下转第６８７页）