天津药学Ｔｉａｎｊｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０１５年第２７卷第１期 ５ 回收率为１０１．３３％，ＲＳＤ为１．９％，见表３。 表３心可宁胶囊樟脑回收率试验结果（／７，：６） 时检测样品中红花以及金橙Ⅱ的存在情况，故选择第 二个展开系统。 金橙Ⅱ（ｏｒａｎｇｅⅡ）又名酸性橙Ⅱ、橙黄Ⅱ、酸性艳 橙、金黄粉、Ｂ一萘酚偶氮对苯磺酸钠，是食品禁用色 素，其化学结构母核与苏丹红相同，为可疑致癌物质， 且有肾脏毒性。近年常发现将其非法添加于红花药材 中以达到着色目的 Ｊ。从心可宁胶囊的处方及生产工 艺可知，方中含有原粉入药的红花药材。在研究心可 宁胶囊红花薄层鉴别时，发现有的厂家样品在 值较 高于红色素点的位置上出现一个橙黄色斑点，经过研 究证实为金橙Ⅱ的斑点，来源考虑为红花药材中非法 添加的物质。 ２．２．１０ 样品测定 取心可宁胶囊样品，分别按 “２．２．３”项下的方法制备样品溶液，各取１ ｌ注入气 《中国药典》２０１０版一部在冰片项下增加了樟脑 相色谱仪，依法测定，按外标法计算结果。测定结果见 检查项，限度为０．５０％ｌ３ Ｊ。心可宁胶囊中检出的樟 表４。 脑，有的为厂家使用樟脑原料代替冰片非法投料，有的 表４心可宁胶囊樟脑测定结果 来源于劣质冰片原料中的超量樟脑杂质。 由上可知，金橙Ⅱ及樟脑均为心可宁胶囊中非法 添加的非处方成分物质。为有效地控制药品质量，严 格打击制假售劣，应加强对心可宁胶囊中金橙Ⅱ及樟 脑的检测。本方法专属性高，灵敏度好，可以满足心可 宁胶囊中金橙Ⅱ的检测及樟脑限量的检查。 ３讨论 参考文献 试验中考查了氯仿一甲醇一冰乙酸（７：１：２）以 】 闵春艳，付凌燕，汪祺，等．红花药材掺伪染色检测方法的实验研究 ［Ｊ］．中国药事，２０１１，２５（８）：７７２—７７５ 及乙酸乙酯一甲酸一水一甲醇（７：２：３：０．４）两个展 ２饶伟文，蒋玲，赵纯玉，等．几种染色掺假中药的化工染料鉴定［Ｊ］． 药物分析杂志，２００７，２７（１１）：１７４２—１７４５ 开系统，结果两个展开系统中金橙Ⅱ均能很好分离，但 ９０４ 是第二个展开系统同时能较好分离红花药材，能够同 ３中国药典『Ｓ］．一部．２０１０：ＨＰＬＣ梯度洗脱法测定氧氟沙星有关物质的方法研究 张琳，曹晓云，袁雯玮 ３０００７０） （天津市药品检验所，天津摘要 目的：建立ＨＰＬＣ梯度洗脱方法同时测定氧氟沙星中的杂质Ａ和有关物质。方法：采用反相高效液相色谱 法，色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＤＢ—Ｃ （２５０ ｍｍ ｘ４．６ ｍｍ，５ ｍ）；以醋酸铵高氯酸钠溶液（取醋酸铵４．０ ｇ和高氯酸钠７．０ ｇ，加水 １ ３００ ｍｌ使溶解，用磷酸调节ｐＨ值至２．２）一乙腈（８５：１５）为流动相Ａ，乙腈为流动相Ｂ，进行线性梯度洗脱；流速为１ ｍｌ／ｍｉｎ；柱温为４０℃；检测波长为２３８ ｎｍ和２９４ ｎｍ。结果：样品中各杂质峰及主峰的分离度和检测灵敏度均满足有关物 质的测定要求。结论：方法灵敏、准确、专属性强，可同时测定氧氟沙星的杂质Ａ和有关物质。 关键词氧氟沙星，有关物质，杂质Ａ，高效液相色谱法，梯度洗脱 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６－５６８７（２０１５）０１－０００５－０５ 中图分类号：Ｒ９２７．１１ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ ｏｆｌｏｘａｃｉｎ ｂｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ＨＰＬＣ － Ｚｈａｎｇ Ｌｉｎ，Ｃａｏ Ｘｉａｏｙｕｎ，Ｙｕａｎ Ｗｅｎｗｅｉ （Ｔｉａｎｊｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７０） ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｕｒｉｔｙ Ａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ ｏｆｌｏｘａｃｉｎ ｂｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅ－ 收稿日期：２０１４－０４－２１ ６ 天津药学Ｔｉａｎｊｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０１５年第２７卷第１期 ｌｕｔｉｏｎ ＨＰＬＣ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ａ Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＤＢ—Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ Ｉｘｍ）ｃｏｌｕｍｎ．Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｄｉｓｓｏｌｖｅ ４．０ ｇ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ７．０ｇ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ ｉｎ １ ３００ ｍｌ ｏｆ ｗａｔｅｒ， ａｄｊｕｓｔｅｄ ｔｏ ｐＨ ２．２ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）一ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（８５：１５）ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ａ，ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ｂ．Ｔｈｅ ｌｆｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ １ ｍｌ／ｍｉｎ，ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ４０℃，ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２３８ Ｕｎｌ ａｎｄ ２９４ ｕｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｕｒｉｔｙ Ａ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ ｏｆｌｏｘａｅｉｎ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，ｉｍｐｕｎＵ Ａ，ＨＰＬＣ，ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ 氧氟沙星为喹诺酮类抗菌药，具有广谱抗菌作用， 药厂生产。 ２方法与结果 尤其对需氧革兰阴性杆菌抗菌活性高。氧氟沙星由日 本第一制药公司在１９８０年研制成功，１９８５年４月获批 准上市。在国内，氧氟沙星由浙江新昌制药厂和中国 医学科学院医药生物技术研究所等单位首先仿制，于 １９９２年６月被批准上市。 ２０１０年之前《中国药典》、《欧洲药典》／《英国药 典》和《美国药典》均以醋酸铵高氯酸钠溶液（取醋酸 铵４．０ ｇ和高氯酸钠７．０ ｇ，加水１ ３００ ｍｌ使溶解，用磷 酸调节ｐＨ值至２．２）一乙腈（８５：１５）为流动相系统等 度洗脱法检查氧氟沙星的有关物质，ＥＰ／ＢＰ在正文后 列出了其７个已知杂质的结构 ｊ，并采用薄层色谱法 检查杂质Ａ，国内尚未见相关的文献报道。本文参考 《中国药典｝２００５年版Ｉ３ 流动相系统，研究建立了测定 氧氟沙星有关物质的ＨＰＬＣ梯度洗脱方法，使保留较 强的杂质Ａ及其他未知杂质得到有效洗脱，并确定了 更为科学有效的分离度试验溶液。 本文建立的方法可在测定氧氟沙星有关物质的同 时对杂质Ａ进行定量检查，较国内外现有的同品种质 量标准更有优势，已被《中国药典￣２ＯＬＯ年版收载。该 方法较各国药典现有方法能更真实、准确地反映氧氟 沙星中有关物质的情况，有助于发现产品的质量问题， 可以更有效地控制生产工艺的稳定性，进而促进产品 质量的提高。 １仪器与试药 １．１仪器Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高效液相色谱仪（ＤＡＤ检测 器）和岛津ＬＣ一２０Ａ高效液相色谱仪。 １．２试药 醋酸铵、高氯酸钠和磷酸均为分析纯，乙 腈为色谱纯。氧氟沙星对照品（批号１３０４５４— ２００６０４，ＨＰＬＣ纯度９８．６％）、氧氟沙星杂质Ａ、Ｂ、Ｅ对 照品（杂质对照品仅供科研用）和环丙沙星对照品（批 号１３０４５１—２００３０２，ＨＰＬＣ纯度８４．９％，供含量测定 用）均由中国药品生物制品检定所提供。氧氟沙星 （批号０７０９２７１、０７１０１９１、０７１２２６２、ＯＦ—Ｍ２００５０７０５、 ＯＦ—Ｍ２００８０４１３和ＯＦ—Ｍ２００８０４１４）及制剂均为国内 ２．１ 色谱条件 色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＤＢ—Ｃ （２５０ ｍｍ×４．６ ＩＴＩＩＴＩ，５ ｔｘｍ）；以醋酸铵高氯酸钠溶液 （取醋酸铵４．０ ｇ和高氯酸钠７．０ ｇ，加水１ ３００ ｍｌ使溶 解，用磷酸调节ｐＨ值至２．２）一乙腈（８５：１５）为流动 相Ａ，乙腈为流动相Ｂ，线性梯度洗脱，时间程序见表 １。流速为１ ｍｌ／ｍｉｎ；柱温为４Ｏ℃；检测波长为２３８ ｎｌＴｌ 和２９４ ｎｍ 表１梯度洗脱程序 ２．２溶液的制备 ２．２．１供试品溶液取本品适量，用０．１ ｍｏｌ／Ｌ盐酸 溶液制成每１ ｍｌ中约含１．２ ｍｇ的溶液。 ２．２．２ 对照溶液 精密称取氧氟沙星对照品适量， 加０．１ ｍｏＬ／Ｌ盐酸溶液溶解并稀释制成每１ ｍｌ中含 ２．４ ｇ的溶液。 ２．２．３杂质Ａ对照品溶液精密称取杂质Ａ对照品 约１２ ｍｇ，置１００ ｍｌ量瓶中，用６ ｍｏｌ／Ｌ氨溶液０．６ ｍｌ 与水适量使溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，精密量取 ２ ｍｌ，置１００ ｍｌ量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为杂 质Ａ对照品溶液，用于杂质Ａ定量。 ２．３ 系统适用性试验称取氧氟沙星对照品、环丙沙 星对照品和杂质Ｅ对照品各适量，用０．１ ｍｏｌ／Ｌ盐酸 溶液溶解并稀释制成每１ ｍｌ含氧氟沙星１．２ ｍｇ、环丙 沙星和杂质Ｅ各６ ｇ的混合溶液。取１０ １注入液相 色谱仪，在２９４ ｎｍ波长下记录色谱图，氧氟沙星峰的 保留时间约为１５ ｒａｉｎ，氧氟沙星峰与杂质Ｅ峰和环丙 天津药学Ｔｉａｎｊｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０１５年第２７卷第１期 ７ 沙星峰间的分离度均应不小２．０，见图１。 ３ 』１ ＾４Ｉ５． ０ １０ ２０ ３０ ４０ ，／ｍｉｎ Ａ ０ １０ ２０ ３０ ４０ ，／ｍｊ１５１ １３２３８ ０ １０ ２Ｏ ３０ ４０ ｔｉｍｊｎ Ｂ２９４ ：； ： ： ０ １０ ２０ ３Ｏ ４０ ｔ／ｍｉｎ Ｃ２３８ ０ ｌ０ ２０ ３０ ４０ ｔ／ｍｉｎ Ｃ２９４ １．杂质Ｂ ２．杂质Ｅ ３．氧氟沙星 ４．环丙沙星５．杂质Ａ ６．杂质１ ７．杂质２ 图１对照品（Ａ）供试品（Ｂ）空白（Ｃ）ＨＰＬＣ色谱图 ２．４专属性试验 取氧氟沙星原料，分别经酸、碱、 光、氧化和热破坏后，在２３８ ｌｑｍ和２９４ ｎｎｌ进样测试。 结果表明，在各种破坏条件下所得的降解产物与主成 分峰分离良好，降解产物峰之间也均能达到基线分离， 该方法专属性好，结果见图２。 ２．５线性关系考查取氧氟沙星和杂质Ａ对照品各 适量，分别制成每１ ｍｌ中约含０．０６ ｍｇ的储备溶液，精 密量取储备溶液各０．５、１、２、５和ｌＯ ｍｌ置５０ ｍｌ量瓶 中，制成系列浓度的溶液，进样测试，考查氧氟沙星 （２９４ ｎｍ检测）和杂质Ａ（２３８ ｎｍ检测）的线性关系。 结果表明，在２９４ ｎｉｎ检测，氧氟沙星溶液浓度在０．６～ ３０ ｍｌ范围内，峰面积与浓度均呈良好的线性关系， 回归方程为Ｙ＝５．５５７ ８ Ｘ １０ Ｘ＋３．９８４ ２ ｘ １０ （ｒ： １．０００ ０）；在２３８ ｎｍ检测，杂质Ａ溶液浓度在０．６～３０ ｍｌ范围内，峰面积与浓度均呈良好的线性关系，回 归方程为Ｙ＝５．５２８ ９×１０ Ｘ＋２．４６０ ２ Ｘ １０ （ｒ＝ １．０００ ０）。 ２．６检出限在２３８ ｎｔＩｌ检测，杂质Ａ最低检 浓度 为０．０４８ ｍ１（相当于供试品溶液的０．００４％）；在 ２９４ Ｆｌｍ检测，杂质Ｂ最低检 浓度为０．０ｌ２ ｍｌ（相 当于供试品溶液的０．００１％），杂质Ｅ最低检出浓度为 ０．０２４ ｇ／ｍｌ（相当于供试品溶液的０．００２％），氧氟沙 星最低检出浓度为０．０２４ ｍｌ（相当于供试品溶液的 ０．００２％）。 ． ２．７溶液的稳定性氧氟沙星供试品溶液室温条件 下放置０、１、２、４和８ ｈ时，分别进样测试，以峰面积计 算，杂质Ａ、最大单一杂质和总杂质的ＲＳＤ分别为 ０．５％、１．２％和１．０％（ｎ＝５）。表明供试品溶液室温 条件下放置８ ｈ内基本稳定。 ２．８供试品溶液浓度与有关物质测定结果的相关性 取氧氟沙星样品，分别制成浓度为０．９６、１．２和１．４４ ｍｇ／ｍｌ的供试品溶液和相应的０．２％的自身对照溶液。 分别依法测定，以峰面积计算，杂质Ａ、最大单一杂质 和总杂质的ＲＳＤ分别为１．５％、１．３％和０．８％。表明 供试品溶液在０．９６～１．４４ ｍｇ／ｍｌ浓度范围内，有关物 质测定结果与溶液浓度有良好的相关性。 ２．９ 方法耐用性 采用①Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＤＢ—Ｃ ８ （２５０ ｍＩＴｌ×４．６ ｍｉＩｌ，５ Ｉｎ）、（ Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ— Ｃ】８（２５０ ｍｍ ｘ ４．６ｒａｍ ５ｔｘｍ）、⑧菲罗门ｌｕｎａ Ｃ１８（２５０ ｍｌＴｌ ｘ４．６ ｈｉｍ，５ ｔｘｍ）和④ＳＧＥ Ｃｌ ８（２５０ ｉｔｌｌｎ ｘ ４．６ ｍｍ， ５ ｔｘｍ）４根不同色谱柱考查分离度测试溶液，主峰与杂 质Ｅ峰和环丙沙星峰间的分离度均不低于２．０。采用 条件①Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高效液相色谱仪，Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＤＢ— ｃ， （２５０ ｍｍ×４．６ ｔｉｒｍ，５ ｍ）色谱柱和条件②岛津 ＬＣ一２０Ａ高效液相色谱仪，Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ—Ｃ ８ （２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ ｔｘｍ）同时考查相同２批样品的 有关物质，测定结果基本一致。上述试验结果表明该 方法耐用性良好。 ２．１０样品的测定结果对２个生产厂家提供的６批 氧氟沙星原料采用以上方法测定有关物质，结果见 表２。 ２．１１ 有关物质限度的确定 本方法采用杂质对照 品外标法对杂质Ａ进行定量；对于除杂质Ａ外其他杂 质，采用不加校正因子的主成分自身对照法测定，与 ＥＰ和ＢＰ一致。由于采用ＨＰＬＣ梯度洗脱法，本法较 同品种其他质量标准多检出杂质Ａ和一较大的未知杂 质，根据样品的测定结果及ＥＰ对杂质Ａ所规定的限 度，本方法限度规定见表３。 ８ 天津药学Ｔｉａｎｊｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０１５年第２７卷第１期 【 ｌ Ｌ０ ２０ ，／ｍｉｎ Ｄ２９４ ．ｈ ３０ ４０ ０ ２０ ，／ｎｌｉｎ Ａ２９４ ３Ｏ ４０ ０ ｔ／ｍｉｎ Ａ２３８ ０ １０ ２０ ｔ／ｍｉｎ Ｄ ２３８ ３０ ４０ ｌ １ ｊ … ０ １０ ２０ ，／ｒａｉｎ Ｂ２９４ ３０ ４０ ＾ ０ ２０ ｌ／ｍｉｎ Ｅ２９４ ３０ ４０ Ｏ ｔ／ｍｉｎ Ｂ２３８ Ｏ １Ｏ ２０ ｔ／ｍｉｎ Ｅ２３８ ３０ ４Ｏ ２ｌ 【 ０ Ｊ Ｉｌ【． １ ２０ ３０ ４０ Ｏ ２０ ，／ｍｉｎ Ｆ２９４ ３０ ４０ ，／ｍｉｎ Ｃ２９４ ｆ】 １０ ２Ｏ １／ｍｉｎ Ｃ２３８ ３０ ４０ ０ １０ ２０ ｆ／ｍｉｎ Ｆ２３８ ３０ ４０ １．氧氟沙星 图２样品（Ａ）酸破坏（Ｂ）碱破坏（Ｃ）光照破坏（Ｄ）氧化破坏（Ｅ）热破坏（Ｆ）ＨＰＬＣ色谱图 天津药学Ｔｉａｎｊｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０１５年第２７卷第１期 ９ 表２样品有关物质检查结果 ３讨论 ＤＡＤ试验结果表明，氧氟沙星和杂质Ａ分别在２９４ ｎｍ ３．１关于系统适用性试验 《欧洲药典》／《英国药 和２３８ ＢＩＴＩ处有最大吸收，杂质Ｅ、杂质１和杂质２最大 典》及《中国药典））２００５年版系统适用性溶液均限定氧 吸收波长均在２９４ ｒｉｍ附近；故本方法选择在２３８ ｎｍ 氟沙星峰与杂质Ｅ峰（相对保留时间约为０．９）的分离 波长处检查杂质Ａ，在２９４ ｎｍ波长处检查其他杂质。 度，未对主峰后紧邻杂质的分离加以控制。而图２供 ３．３氧氟沙星制剂的测定 有关物质测定方法的关 试品溶液色谱图中标示的未知杂质“杂质１”在部分氧 注点在于方法的灵敏度和专属性，即杂质被有效地检 氟沙星原料及制剂中均可检出，最高可达０．２５％，因此 出。本文采用梯度洗脱的方法，不仅能将保留较强的 对氧氟沙星与其后杂质的分离度加以限定是必要的。 杂质Ａ洗脱，还可检出更多未知杂质，更能体现样品的 对不含杂质１的样品进行各种强制破坏后均未得到主 真实情况；采用２９４ ｎｍ和２３８ ｎｍ双波长检测还可同 峰后紧邻的杂质；以梯度洗脱系统考查环丙沙星、诺氟 时对杂质Ａ进行定量，较薄层色谱法更为准确。采用 沙星等十几种同类物质，得到环丙沙星峰与氧氟沙星 本文方法分析不同企业生产的氧氟沙星片、胶囊、注射 峰的相对保留时间约为１．１，与杂质１的保留时间最为 液和滴眼液等制剂，辅料均无干扰，因此本方法可同时 接近。因此规定以氧氟沙星与杂质Ｅ（相对保留时间 用于氧氟沙星系列制剂的有关物质（包括杂质Ａ）测 ０．９）和环丙沙星（相对保留时间１．１）进行系统适用性 定。 分离度的试验，分离度均不低于２．０，可保证主峰与其 前后相邻杂质峰有效分离。 参考文献 １ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ６．０［ｓ］．２００７：２５４１—２５４２ ２ Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２００９［ｓ］．２００８：１５７８—１５７９ ３ 中国药典ｆＳ１．二部．２００５：６０５ ３．２检测波长的选择 《中国药典））２００５年版、《欧洲 药典》／《英国药典》均采用２９４ ｎｍ作为检测波长。经