产腈水合酶菌株的驯化研究

圈　２００６，ＶｏＩ．２３　ＮＯ．４亿学局健助Ｚ彳Ｃｈ墨　ｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　产腈水合酶菌株的驯化研究　李志东　。宋旭鹭　。梁伟　。张洪林　。邱　峰　，蒋林时　。邱　江　（１．辽宁石油化工大学环境工程系，辽宁抚顺ｌ１３００１；２．抚顺石油三厂，辽宁抚顺ｌ１３００１）　摘　要：以Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６１１为出发菌株．通过逐渐增加培养基中丙烯腈的浓度重复继代培养，得到一株酶，　活为７２．５　Ｕ・ｍｇ　的腈水合酶高活力茼株Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．１　ＮＳＹ０６１ｌＸＨ．酶活比出发菌株提高了１５倍。初步确定驯化　最优蒂件为：葡萄糖２０　ｇ－ｌ　～、诱导荆脲０．０６　ｇ・Ｌ　、Ｃｏ　０．３　ｇ・Ｌ　、丙烯酰胺１Ｏ　、温度３Ｏ℃及ｐＨ　７。在此条件　下，腈水合酶可高效表达　关键词：腈水合酶ｌ诺卡氏茼；驯化选育；产酶条件　中圈分类号：ＴＱ　９２０．】　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７２—５４２５（２００６）ｏ４—００３８—０３　腈化合物一般属于高毒性化合物，然而一些微生　１．２培养基　斜面培养基组成（ｇ）：葡萄糖１５，酵母膏５。　Ｋ２　ＨＰ（１）４　２，ＮａＣ１　１，ＭｇＳ（＿）　・７Ｈ２（）ｏ．１２，琼脂２Ｏ，　Ｈ２Ｏ　１０００　ｍＬ，调ｐＨ一７．２～７．６，１×１０　Ｐａ，灭菌　２Ｏ　ｍｉｎ。　物能利用此类化合物作为它们生长所必需的碳源和氮　源。通过对这些菌进行分离纯化及进一步的驯化培　养，可获得多株产腈水合酶的高产菌株。腈水合酶是　一类能催化腈类化合物转化为相应的酰胺类化合物的　同工酶，不同菌株的腈水合酶在结构和特性上存在着　发酵培养基组成（ｇ）：葡萄糖２Ｏ，酵母膏５。　较大的差异【　］。目前已知能产生腈水合酶的微生物有　Ｋ２ＨＰＯ４　０．１５，ＫＨ２ＰＯ　０．１５，尿素７，谷氨酸钠ｌ，　ＭｇＳ（）　・７Ｈ２Ｏ　０．１２，微量元素，Ｈ２Ｏ　１０００　ｍＩ　，调ｐＨ　＝７．５，１×１０　Ｐａ，灭菌２０　ｍｉｎ。　红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒状杆菌、假单胞菌、　产碱杆菌、短杆菌等，可见产腈水合酶菌的分布相当广　泛　。　作者采用辽宁石油化工大学生物工程实验室筛选　并保藏的Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６１１菌株经过培养条　件优化后发酵，得到一株高效菌株Ｎ　ａｒｄｉａ　ｓｐ．Ｉ　Ｎ—　ＳＹＯ６１１ＸＨ，其腈水合酶活力达到７２．５　Ｕ・ｍｇ一’。　１．３菌种的培养方法　将菌种Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６１１从平皿接种于　发酵摇瓶中，１０００　ｍＩ　发酵摇瓶的装液量为１００　ｍｌ　培养基，于２８℃下培养９６　ｈ，摇床转速２４０　ｒ・ｍｉｎ一　取一定量发酵液，在４０００　ｒ・ｍｉｎ　。条件下离心分离　ｌ０　ｍｉｎ，弃去上层清液，用ｐＨ　７．５的磷酸盐缓冲溶液　ｌ　实验　１．１仪器与原料　ＨＨ一６型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；　洗涤菌体。在同样的条件下重复离心分离、洗涤操作，　制成等浓度的均匀菌悬液，冰箱保存，备用。取一定体　积菌悬液，加入装有丙烯腈溶液的反应釜中，恒温水浴　振荡。每隔一段时问，取少许至离心管中，并加入一滴　浓度为３　ｍｏｌ・Ｌ　的盐酸终止反应，在４０００　ｒ？ｍｉｎ　条件下离心１０　ｒａｉｎ后，分析反应液组成。　１．４菌株驯化选育实验　］　ｌＯｌ—ｌ型电热鼓风干燥箱，上海沪南科学仪器厂；ＦＡ一　２００４电子分析天平，上海科学仪器厂；ＧＣ一１７Ａ型气相　色谱仪，日本岛津；ＴＵ一１０００型紫外可见分光光度计，　北京通Ｊ＋ｊ仪器设备公司；ＰＨＳ一３Ｂ型精密ｐＨ计，上海　雷磁仪器厂；ＨＹＧ－Ⅱ型摇瓶柜，上海欣蕊自动化设备　有限公司。　逐渐增加培养基中丙烯腈的浓度，对菌株进行驯　化选育。营养因子实验：以添加诱导剂的发酵基础培　诺卡氏菌Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．Ｉ　ＮＳＹ０６１ｌ，从抚顺腈纶　厂污水处理场活性污泥中筛选。辽宁石油化　ｒ大学生　物丁程实验室保藏。　丙烯腈。化学纯，９９．０　，上海试剂三厂；丙烯酰　养基为基础（每２５０　ｎｌＬ　ｉ角瓶中培养基体积皆为　２５　ｍＩ　），根据不同宴验要求进行配制。在葡萄糖梯度　实验中，每瓶培养基分别含有下列浓度的葡萄糖（ｇ・　Ｉ　。。）：５、１０、１５、２Ｏ、２５、３０；在发酵基础培养基中，首先　胺，分析纯，９８　９／６，北京化学试剂公司。　基金项目：抚顺精细化工研发中心与辽宁省石油化工大学生物工程实验室共同资助项目　收稿日期：２００６…０Ｉ—Ｉｌ　作者简介：李志东（１　９７８一）。男。辽宁大连人．硕士研究生，从事＇ｋＮ４ｇ．￣的研究；通讯联系人：张洪林，教授。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｚｄ　ｘｘ＠】６３．ｃｏｍ。　维普资讯 http://www.cqvip.com

李志东等：产腑水台酶菌株的驯化研究／２ｏｏ６正一４■　圈　考察Ｃｏ¨、Ｆｅ汁、Ｍｇ　、Ｚｎ　等金属离子对腈水合酶　２．２　ｐＨ值对腈水合酶合成的影响　的影响情况，确定具体的金属离子后进行梯度实验，每　对培养ｐＨ值进行梯度实验，分别考察Ｎｏｃ・ａｒｄｉａ　瓶培养基分别含有下列浓度的金属离子（ｇ・Ｌ＿１）：　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６ｌ】在不同ｐＨ值下的摇瓶产酶情况，结　０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６。接种后丁３Ｏ℃旋转式　果见图２。由图２可知，当ｐｆｉ在６～７时，菌体生物量　摇床（偏心距３＋５）１５Ｏ　ｒ・ｍｉｎ～　振荡培养，培养结束后　和胞内腈水合酶含是的水平都较高．且在ｐＨ为７时　测定相应的菌体细胞生物量及酶活力。　达到最大，在ｐＨ大于８时明艟下降。故确定最佳ｐＨ　１．５腈水合酶的诱导实验　为７进行后续实验。　在确定了葡萄糖及金属离子初始浓度的发酵基础　培养基中，分别考察下列物质对酶的诱导作片】：腈化　二　物、脲、酰胺，确定诱导荆后进行诱导剂浓度实验。培　养条件同前，培养结束后测定相应的菌体细胞生物量　己　及酶活力。培养条件实验：考察ｐＨ　４．ｏ～９．０、温度　藿　２２－－－３２℃对腈水合酶合成的影响。　１．６测定方法Ｌ４　丙烯酰胺（ＡＭ）生成量及酶活的测定采用　ＫＢｒＯ３一ＫＢｒ法。　图２　ｐｔ］值对腈水合酶合成的影响　ＡＭ的生成量一Ｎ（Ｖ　一Ｖ）×３５．５　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｎ　ｎｉｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ｙｉｅｌｄ　酶活一Ｎ（Ｖ　一Ｖ）×３５．５×Ｖｌ／（　！×，）　２．３葡萄糖浓度对腈水合酶合成的影响　式中，Ｎ为Ｎａ２Ｓ．　Ｏ　溶液的摩尔浓度，ｍｏｌ－　对培养基中葡萄糖浓度进行梯度实验，分另０考察　Ｉ　；Ｖ　为空Ｆ１所消耗的Ｎａ：Ｓ：（）　溶液体积，ｍＩ　；Ｖ　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹＯ６１１　／ｆ　同葡萄糖浓度下的摇　为样品消耗的Ｎａ。Ｓ？Ｏ：　溶液体平只，ｍＩ　；Ｖ．为反应生成　瓶产酶情况，结果见　３。ｆｌ１　３町知，当葡萄糖浓度　的ＡＭ溶液总体积，ｍＬ；Ｖ　为所测定反应上层清液体　在１　５～２５　ｇ・Ｉ　时，菌体生物址和胞内腈水合酶含　积，ｍＩ　；　为反应的时　，ｈ。　量的水平都较高，且在２０　ｇ・ｌ　时达到最大。故选　反应速率的测定采用　歇法，即每隔一定时间取　择最佳葡萄糖浓度为２０　ｇ・Ｉ　进行后续实验。　样分析反应液组成。　ｌ】Ｏ　２结果与分析　ｌＯ５　’普１００　２．１　温度对腈水合酶合成的影响　喜９５　对培养温度进行梯度实验，分别考察Ｎ　’ａｒｄｉａ　藿９０　ｓｐ．Ｉ．ＮＳＹｏ６ｌｌ在不同温度下的摇瓶产酶情况，结果见　８５　图　ｌ。由图ｌ可知，当温度在２８～３２℃时．菌体生物量　８０　０　５　１０　ｌ５　２Ｏ　２５　３０　和胞内腈水合酶含量的水平都较高，且在３Ｏ℃时达到　葡萄糖浓度／ｇ・　最大。故选择最佳温度为３Ｏ℃进行后续实验　图３葡萄糖浓度对腈水合酶合成的影响　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｃｏｎｃｅｒｔ／ｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｎｉｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ｙｉｅｌｄ　Ｔ　曲　旨　２．４钴离子浓度对腈水合酶合成的影响　３　经实验选定金属钻作为诱导剖，对培养基中钻离　蓝　罐　子浓度进行梯度实验．分别考察Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．Ｉ　Ｎ—　ＳＹ０６１　ｌ在不同钻离于浓度下的摇瓶产酶情况，结果见　图４。ｆ｝ｊ图４可知，　钻离子浓度在ｏ．２～Ｏ．４　ｇ・Ｉ　时，菌体生物罐　平１】胞内腈水合酶禽量的水平都较高，且　图ｌ　温度对腈水台酶合成的影响　在ｏ．３　ｇ・ｌ　时达刮最大。故选挣最佳钻离子浓度　Ｆｉ　ｌ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏＮ　ｎｉｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ｙｉｅｌｄ　为０．３　ｇ・Ｌ　进行后续变验　维普资讯 http://www.cqvip.com

Ｉ－曹目．ｎ、　恤蕊　Ｉ－　皿　日．八杀蜒谧　李志东等：产脯水合群菌株的驯化研究／２０Ｏ６匿一４■　如　∞∞∞柏加　０　当丙烯酰胺质量分数在ｌＯ　～２Ｏ　９，５时，菌体生物量和　胞内腈水合酶含量的水平都较高。故选择最佳丙烯酰　胺质量分数为１Ｏ　进行后续实验。　０．０　０　ｌ　０．２　０．３　０．４　０　５　０　６　钻离于浓度，ｇ・Ｌ－　图４钴离子浓度对腈水合酶合成的影响　Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＣＯ２　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｎｉｔｒｉｌｃ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ｙｉｅｌｄ　２．５脲浓度对腑水合酶合成的影响　丙烯酰胺质茸分数，％　对培养基中脲浓度进行梯度实验，分别考察Ｎｏ—　图６丙烯酰胺质■分数对腈水合酶合成的影响　ｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６１ｌ在不同脲浓度下的摇瓶产酶情　Ｆｉｇ．６　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｃｒｙｌａｍｉｄｅⅡ璐ｓｆｒａｃｔｉｏｎｏｎ　ｎｉｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔｅｓｅ　ｙｉｅｌｄ　况，结果见图５。由图５可知，当脲浓度在０．０４＂：０．０８　∞日．　、　落　ｇ・Ｉ　时，菌体生物量和胞内腈水合酶含量的水平都　３　结论　较高，且在０．０６　ｇ・Ｌ　时达到最大。故选择最佳脲　以Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６１１为出发菌株，通过逐　浓度为０．０６　ｇ・Ｌ　进行后续实验。　渐增加培养基中丙烯腈的浓度重复继代培养的方法，　选育出一株酶活力为７２．５　Ｕ・ｍｇ　的腈水合酶高活　力菌株，命名为Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６１１ＸＨ，其酶活　比出发菌株提高了１５倍。　确定驯化诺卡氏菌Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６１１ＸＨ　的最佳条件为：温度３Ｏ℃、ｐＨ为７、葡萄糖浓度为２Ｏ　ｇ・Ｉ　一　、诱导剂钻离子浓度为０．３　ｇ・Ｉ　、脲浓度为　０．０６　ｇ・Ｌ一　、丙烯酰胺质量分数为１Ｏ　。　脲浓度，ｇ・Ｌ『　参考文献：　图５脲浓度对腈水合酶合成的影响　［１］刘铭，李春，黄星．等．Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．腈水合酶的纯化过程研究　［Ｊ］．高校化学１　程学报．２００４。１８（３）：３２４—３２６．　Ｆｉｇ。５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｕｒｅａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｎｉｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ｙｉｅｌｄ　［２］马武生，马同森，杨生玉．腈水合酶及其在丙烯酰胺生产巾应用的　２．６丙烯酰胺质量分数对腈水合酶合成的影响　研究进展［Ｊ］．化学研究。２００４，１５（１）；７５－７６．　对培养基中丙烯酰胺质量分数进行梯度实验，分　［３］　杨，扛玉，马武生．马同森．丙烯腈水台酶催化动力学及失活动力学　别考察Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．ＬＮＳＹ０６ｌ１在不同丙烯酰胺质　研究［Ｊ］．郏州轻Ｔ业学院学报（自然科学版），２００４，１９（１）：５６—６０．　［４］陈跖，孙旭东，史悦，等．微生物法生产丙烯酰胺的研究（Ｉ）［Ｊ］．生　量分数下的摇瓶产酶情况，结果见图６。由图６可知，　物］　程学报，２００２，１８（１）：５５　５８．　Ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ　Ｏｆ　ａ　Ｎｉｔｒｉｌｅ　Ｈｙｄｒａｔａｓｅ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｓｔｒａｉｎ　ＬＩ　Ｚｈｉ－ｄｏｎｇ　，ＳＯＮＧ　Ｘｕ。ｌｕ　，ＬＩＡＮＧ　Ｗｅｉ　，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｌｉｎ　，ＱＩＵ　Ｆｅｎｇ　，ＪＩＡＮＧ　Ｌｉｎ—ｓｈｉ　，ＱＩＵ　Ｊｉａｎｇ￣　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ、Ｉ　ｏ　ｒ’Ｐｅｔｒｏｌｅｕｎ“７ｌ（ｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｕｓｈｕｎ　１１３００１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｆｕｓｈｕｎ　０ｉｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｎｏ．３，Ｆｕｓｈｕｎ　１１３００１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ｈａｖｉｎｇ　ｈｉｇｈｅｒ　ｎｉｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｔｏｌｅｒ—　ａｎｔｅ，ｎｕｍｂｅｒｅｄ　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．Ｉ　ＮＳＹ０６　１】ＸＨ，ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｂｙ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｓｕｂｃｕｈ　ｕｒｉｎｇ　ｆ　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．Ｉ　Ｎ—　ＳＹ０６１１　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｒｏｔｈ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ　ｗｉｔｈ　ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｎｉ—　ｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．Ｉ　ＮＳＹ０６１１ＸＨ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｕｐ　ｔｏ　７２．５　Ｕ・ｍｇ～ｏｆ　ｄｒｙ　ｃｅｌｌｓ，１５　ｔｉｍｅｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．Ｉ．ＮＳＹ０６　１　１．Ｔｉｌｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｎｉｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｍｏｓｔｌｙ　ｗｅｒｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ，ｕｒｅａ，ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ，Ｃｏ川ａｎｄ　ｐＨ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：　ｇｌｕｃｏｓｅ　２０　ｇ・Ｉ　～，ｕｒｅａ　０．０６　ｇ・Ｌ～　，ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　１０　，Ｃ０　０．３　ｇ・Ｉ　，ｐＨ　７　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　３０℃．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎ“ｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ；Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．；ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ；ｎｉｔｒｉｌｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ