第３Ｏ卷第２期 ２０１５年４月 安徽工程大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖ０１．３Ｏ．ＮＯ．２ Ａｐｒ．，２０１５ 文章编号：１６７２—２４７７（２０１５）０２—０００６—０６ 一株产漆酶真菌的筛选～鉴定及发酵研究 陈守菊，李 松，陈阿娜，汤文晶，刘 宇，汤 斌 （安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖 ２４１０００） 摘要：采用愈创木酚显色法筛得一株产漆酶周期较短的丝状真菌。通过形态学观察和分子生物学序列分析，鉴 定其为棘孢木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ），并对所获菌株进行了发酵条件优化．通过单因素试验和正交试验 获得该菌的最佳发酵条件为：蔗糖２５ ｇ／Ｌ、麸皮汁８０ ｇ／Ｌ、酒石酸铵１０ ｇ／Ｌ和豆粕１８ ｇ／Ｌ，ＫＨ。ＰＯ ２， ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ Ｏ．６，ＣａＣｌｚ・２Ｈ２Ｏ Ｏ．８，Ｃｕ。 Ｏ．２５（１ ｍＭ），ｐＨ ５．５－－６．５，其漆酶最高酶活水平为５７１．３２ Ｕ／Ｌ． 关键词：漆酶；棘孢木霉；分子鉴定；发酵优化 文献标识码：Ａ 中圈分类号：Ｑ９３—３３１ 漆酶（Ｌａｃｃａｓｅ，ＥＣ １．１０．３．２）最早发现于日本紫胶漆树Ｒｈｕｓｖｅｒｎｉｃｉｆｅｒａ的浸出液中，是一种含铜的多 酚氧化酶，能够在氧气作为电子受体的条件下氧化芳香族化合物，且可催化的底物非常广泛．随后，几乎在 所有已研究的木腐真菌中均有发现，同时也存在于部分植物、细菌和昆虫之中［ ．随着漆酶的发现和深入 研究，在某些小分子化合物作为介体存在的条件下，漆酶还能够氧化非酚型木质素结构．漆酶对木质素以 及与木质紊结构相似的许多环境污染物的降解作用越来越受到人们的重视［２］．在纸浆去木质化 、有机染 料脱色［ 、纺织污水处理［引、生物传感器［ 、食品饮料行业 、有机合成 ］、药物合成ｍ］、医疗诊断和作为 抗癌药物制备的催化剂［１ 、生物防治 、生物能源［ｔ４－１ ５］等方面。表现出了重要的研究价值和应用潜力，因 而日益受到重视． 已报道文献指出，高等真菌尤其是担子菌中的白腐真菌［１ （Ｗｈｉｔｅ—ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ）是目前最有效的漆酶产 生菌种之一．但是从漆酶生产工业化应用的角度出发，目前研究的漆酶产生菌株仍具有发酵产酶时间长或 发酵活力较低等缺点，仍不适用于漆酶的大规模工业化生产。在一定程度上限制了漆酶的广泛应用．因此， 为了更好地满足生产需求，筛选具有发酵时间短及发酵活力高等特点的漆酶产生菌株依然是一个长远而 艰巨的研究任务．本文采用愈创木酚显色法Ｉ１ ］对多个自然样本进行筛选，获得一株发酵时间较短的漆酶 产生菌株． １材料与方法 １．１ 材料 （１）筛选样本．分离样本采集于安徽省芜湖市神山公园、赭山公园和清水苗圃园等富含腐烂植物茎叶 组织的土壤． （２）培养基．ＰＤＡ培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２Ｏ，土豆（浸出汁）２００，琼脂粉１５，ｐＨ值自然．筛选培养基： ＰＤＡ培养基添加愈创木酚（Ｏ．０４ ）及卡那霉素（５０ ｍｇ／Ｌ）．种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２Ｏ，蛋白胨５，酵母 粉３，ｐＨ值自然．基本发酵产酶培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２０，酒石酸铵８，ＫＨ ＰＯ ２，ＭｇＳＯ ・７Ｈ Ｏ ０．６， ＣａＣＩ２・２Ｈ２Ｏ ０．８，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．２５，Ｔｗｅｅｎ８０ ０．２５，ｐＨ ６．０． （３）主要试剂与仪器．工具酶、ＰＣＲ产物回收、纯化等ＤＮＡ操作试剂盒、抗生素和愈创木酚等购自生 工生物工程（上海）股份有限公司和宝生物工程（大连）有限公司．其他化学试剂均为国药集团化学试剂有 限公司产品．麸皮、豆粕、玉米粉和豆渣等生物原材料为市购． Ａｌｌｇ６４Ｒ高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）；ＳｌＯＯＯ Ｂｉｏ—Ｒａｄ ＰＣＲ仪（美国伯乐Ｂｉｏ—ｒａｄ）；Ｓ一４８００高分 辨率场发射扫描电镜（日本日立公司）；ＦＤ８—３真空冷冻干燥机（美国ＳＩＭ公司）；雷磁ＰＨＳ－３Ｅ ｐＨ计（上 收稿日期：２０１５—０２—０２ 基金项目：安徽省自然科学青年基金资助项目（１４０８０８５ＱＣ６Ｉ） 作者简介：陈守菊（１９８８一），女，安徽颍上人，硕士研究生． 通讯作者：汤斌（１９５４一），男，安徽桐城人，教授，硕导． 第２期 陈守菊，等：一株产漆酶真菌的筛选、鉴定及发酵研究 海仪电科学仪器股份有限公司）；ＧＨＺ一１２３Ｂ恒温培养箱（太仓市华美生化仪器厂）． １．２ 方法 （１）产漆酶真菌的筛选．将采集的样本在无菌环境中进行打碎并进行梯度稀释．分别取２００ Ｌ各样本 梯度稀释液涂布于筛选平板，３Ｏ℃条件下恒温培养３～４ ｄ后挑取具有红褐色氧化圈的菌落进行分离和纯 化．在完全相同的培养条件下。挑取在一定时间内产生红褐色氧化圈较大的菌株进行复筛和后续实验． （２）漆酶产生菌株的显微形态观察．将在平板上出现氧化圈较大的漆酶产生菌株在３０℃下恒温培养 ４ ｄ，形成巨大菌落，取菌丝制片，分别进行光学显微镜和扫描电镜观察，以研究菌丝及孢子形态特征． （３）漆酶产生菌株的分子生物学鉴定．分离菌株染色体ＤＮＡ的提取、质粒ＤＮＡ的小量制备及ＤＮＡ 的酶切、连接、转化等分子操作及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：参见《分子克隆实验指南》（第二版）进行．其中，以ＣＴＡＢ抽 提法获得的该菌株染色体ＤＮＡ为模板，以５．８ Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区域通用引物（ＩＴＳ１：５＂－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴ— ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ一３ 。ＩＴＳ４ｌ ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ．３ ）为扩增引物，使用ＰＣＲ方法获得该菌株 ５．８ Ｓ ｒＤＮＡ—ＩＴＳ片段并测序，序列测定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成．通过在线数据库 Ｂ１ａｓｔ／ｂ１ａｓｔｐ（ｈｔｔｐｌ／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ）对测定序列进行比对，并使用ＭＥＧＡ ５．１软件通过 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ—Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）法构建系统发育树． （４）发酵种子液的制备．菌种在ＰＤＡ培养基中培养３ ｄ后用无菌水洗下孢子，使用血球计数板计算孢 子数并稀释至１×１Ｏ 个／ｍＬ．按１ ９／５接种量接人装液量２０ （２５０ ｍＬ三角瓶）种子培养基，于３０℃、 ２００ ｒ／ｍｉｎ条件下培养２４ ｈ后作为种子液备用． （５）漆酶摇瓶发酵条件优化．改变基本发酵产酶培养基中的碳源、氮源、初始ｐＨ值等条件以研究单因 素对菌种产漆酶的影响．确定较优的单因素后利用正交设计方法对单因素进行组合优化．发酵条件：发酵 液装液量为２０％（２５０ ｍＬ三角瓶）。初始ｐＨ为６．０，接种量为１０ ，温度和转速分别为３０℃和２００ ｒ／ｍｉｎ． 发酵至不同时间取样并于１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取上清进行酶活力测定． （６）酶活力测定．采用ＡＢＴＳ法测定漆酶酶活［１ ．取１．５ ｍＬ ０．５ ｍＭ ＡＢＴＳ底物溶液（溶解于０．１ Ｍ， ｐＨ ４．０的醋酸／醋酸钠缓冲液）与１．５ ｍＬ适当稀释的酶液在４Ｏ℃进行反应，测定反应前３ ｍｉｎ内４２０ ａｍ 处吸光值的变化．定义１ ｍｉｎ内氧化１ ｇｍｏｌ ＡＢＴＳ所需要的酶量为一个漆酶活力单位（Ｕ）． （７）漆酶的反应动力学参数。以ＡＢＴＳ为底物，改变底物添加量（２０ Ｌ、３２ Ｌ、５Ｏ Ｌ、１００ Ｌ、２００ Ｌ、 ５００ ｇＬ），在最适温度和最适ｐＨ的条件下测定漆酶活力，按照Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ作图法制作双倒数图．由 直线的截距计算Ｖ 和Ｋ ． ２结果与分析 ２．１产漆酶菌株筛选 在２７个自然样本的筛选平板中共得到２个可产生红褐色氧化圈且菌落形态具有明显差异的菌株，可 能均是潜在的漆酶产生菌株．其中，在第１Ｏ号样本中得到的菌株生长较快且所产氧化圈较大，将该菌株命 名为ＬＳ一１０．挑取菌株ＬＳ－ＩＯ进行培养并观察其巨大菌落和显微形态，如图１所示．该菌株在ＰＤＡ平板上 生长较快，菌落开始呈白色、致密、圆形、向四周扩展，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色，菌落周 围有白色菌丝生长带．菌丝纤细，宽度约１．０～２．０ ｍ，产生分生孢子．孢子簇生，呈不规则椭圆形，有凹，直 径约４ｇｍ．根据形态学观察结果初步将ＬＳ－ＩＯ鉴定为木霉属微生物． 菌株在筛选培养基中产生红褐色氧化带正面照片如图１ａ所示；菌株在筛选培养基中产生红褐色氧化 带背面照片如图１ｂ所示；菌株在ＰＤＡ培养基中的巨大菌落如图１ｃ所示；菌丝光学显微镜观察形态（４００ 倍）如图１ｄ所示；菌株分生孢子梗形态（ＳＥＭ ３５００倍）如图１ｅ所示；分生孢子形态（ＳＥＭ ２５０００倍）如图 １ｆ所示． ２．２产漆酶菌株分子生物学鉴定 将ＬＳ－ＩＯ菌株的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列测定结果与ＧｅｎＢａｎｋ中已登录的序列进行Ｂｌａｓｔ比对，选择同 源性较高的菌株序列进行分析，使用ＭＥＧＡ５．１软件中的Ｎｅｉｇｈｂｏｒ—Ｊｏｉｎｉｎｇ程序构建系统进化树，如图２ 所示．由图２可知，该菌株与棘孢木霉Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ的相似性较高，结合形态学鉴定结果，将该 菌株鉴定为棘孢木霉，并命名为棘孢木霉ＬＳ＿１Ｏ． 安徽工程大学学报 第３Ｏ卷 过程中的关键影响因素． 一 ｆｌ一茸一言ｇ§＂ｖｇ，Ｉ ８０ １００ ｂ １２Ｏ ８ １０ ｃ １２ ｌ４ １８ ｄ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ￣ｖｅｌｓ 圈９正交试验中各因素水平（ｇ／Ｌ）对菌株ＬＳ－ＩＯ发酵产漆蕊影响分析 ２．５漆酶的反应动力学参数 Ｋ 是酶的一个重要特征，反应了酶同底物的亲和 力大小．本实验以ＡＢＴＳ为底物，在最适温度和最适ｐＨ 条件下，测定该酶在不同底物浓度时的酶活，按照 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ作图，结果如图１０所示．计算出Ｖ ： ３．６８ ｍＭ／ｍｉｎ和Ｋ ＝０．０１８ ｍＭ，动力学分析表明该酶 与底物的亲和力较大． ３讨论 １４Ｓ］（Ｉ／ｍＭ） 通过愈创木酚显色法，从土壤中筛选到一株快速产 漆酶的丝状真菌，结合形态学和分子生物学方法鉴定， 图１Ｏ漆酶的双倒数图 确定所筛菌株为棘孢木霉．逐步利用单因素试验及正交试验对该菌株的发酵进行优化，确定该菌株产漆酶 最佳发酵培养基和发酵条件．碳源是菌体碳架及能量的来源，不同菌株生长和产酶的最适碳源也大都不 同．白腐菌的最佳碳源主要有麸皮、蔗糖、葡萄糖及麦芽糖等，最佳氮源主要有豆粕、酵母粉、蛋白胨、硝酸 铵及酒石酸铵等［１ ．研究发现该菌株以麸皮汁、蔗糖和半乳糖为碳源时产酶水平较高，以酒石酸铵、豆粕 和蛋白胨为单一氮源时产酶水平较高，都与白腐菌的最适碳氮源相似．其中，碳源浓度的变化对该菌株产 漆酶影响较大，可能是该菌种发酵产酶过程中的关键影响因素． 培养基初始ｐＨ直接影响到菌株生长和产酶活动，有大量研究资料表明，真菌产漆酶的最适ｐＨ通常 为弱酸性．该菌株产漆酶对初始ｐＨ比较敏感，在弱酸性ｐＨ（５．５～６．５）条件下较利于漆酶表达，而过高或 过低的ｐＨ均不利于漆酶的产生．同时研究发现，不加铜离子时，发酵液中几乎检测不到酶活，低浓度的铜 离子（１ ｍＭ）对该菌株产酶具有显著的促进作用，而高浓度的铜离子则有强烈的抑制作用，这表明了铜离 子作为漆酶的催化活性中心，在发酵产漆酶的过程中是不可或缺的．综上，研究中确定该菌株最佳的产酶 条件为（ｇ／Ｌ）：蔗糖２５，麸皮汁８０，酒石酸铵１Ｏ，豆粕１８，Ｉ ｍＭ Ｃｕ抖，ＰＨ ５．５～６．５时，漆酶最高酶活力达 到５７１．３２ Ｕ／Ｌ，高于之前已经报道的棘孢木霉最高漆酶酶活５００ Ｕ／Ｌ．研究结果表明，对棘孢木霉产酶条 件进行的优化是有效的，且动力学分析表明，该酶与底物的亲和力较大，这为漆酶的实际应用提供了有价 值的参考信息． 参考文献： ［１］司静，李伟，崔宝凯，等．真菌漆酶性质，分子生物学及其应用研究进展Ｉ－Ｊ］．生物技术通报，２０１１（２）：４８—５５． Ｅ２］Ｐ Ｇｉａｒｄｉｎａ，Ｇ Ｓａｎｎｉａ．Ｌａｃｃａｓｅｓ：ｏｌｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｆｕｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５，７ （２５）：１－２． ［３］Ｈ Ｌａｎｇｅ，Ｓ Ｄｅｃｉｎａ，Ｃ Ｃｒｅｓｔｉｎｉ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｕｐｇｒａｄｅ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ－Ｒｅｃｅｎｔ ｒｏｕｔｅｓ ｒｅｖｉｅｗｅｄ［－Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｐｏｌｙｍｅｒ ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３， ４９（６）：ｌ １５ｉ－１ １７３． ［４］Ｓ Ｒａｎｇａｂｈａｓｈｉｙａｍ，Ｎ Ａｎｕ，Ｎ Ｓｅｌｖａｒａｊｕ．Ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｌａｃｃａｓｅ ｉｎ ｔｅｘｔｉｌｅ ｄｙｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ－ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｒｅ— ｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１３，１７：８８—９５． ［５］Ｍ Ｉｍｒａｎ，Ｄ Ｅ Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ａ Ｋｈａｌｉｄ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｘｔｉｌｅ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ 第２期 陈守菊，等：一株产漆酶真菌的筛选、鉴定及发酵研究 ・１１・ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１４（１）：１—２Ｏ． ［６３ Ｐ Ｄａｓ。Ｌ Ｂａｒｂｏｒａ，Ｍ Ｄａｓ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｌａｃｃａｓｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｏｎ ｎａｎｏ－ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ ｉｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓａｍｐｌｅｓ口］．Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ，２０１４， １９２：７３７－７４４． ｔｚ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｎｄ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｒｅａｃ‘ ［７３ Ｔ Ｋｕｄａｎｇａ，Ｇ Ｓ Ｎｙａｎｈｏｎｇｏ，Ｇ Ｍ Ｇｕｅｂｉｔｉｏｎｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，４８（３）：１９５—２０８． ａｂｉ，Ｍ Ａ Ｆａｒａｍａｒｚｉ．Ｌａｃｃａｓｅ ａｎｄ ｌａｅｃａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ａｄ— ［８３ Ｍ Ｍｏｇｈａｒｖａｎｃｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ８Ｌ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，２０１４，３５６（５）：８９７—９２７． ［９］ Ｉ Ｇｉｔｓｏｖ。Ｌ Ｗａｎｇ，Ｎ Ｖｌａｄｉｍｉｒｏｖ，ｅｔ ａ１．“Ｇｒｅｅｎ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｐｏｌｙ（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）ｓ ｗｉｔｈ Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ ａｎｄ ｐＨ－Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ，Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｌｉｎｅａｒ－Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｌａｃｃａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１４， Ｉ５（１１）：４ ０８２－４ ０９５． Ａ Ａｌｊａｗｉｓｈ，Ｉ Ｃｈｅｖａｌｏｔ，Ｊ Ｊａｓｎｉｅｗｓｋｉ，ｅｔ ａ１．Ｌａｃｃａｓｅ－ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｅｔｈｙｌ ｆｅｒｕｌａｔｅ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉ－ ［１Ｏ］ ｕｍ：Ａ ｇｒｅｅｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｅｗ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，１４５｛１ ０４６—１ ０５４． ［１１］ Ｊ Ｍ Ｗｏｏｄｌｅｙ．Ｎｅｗ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｌ ｍａｋｉｎｇ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｇｒｅｅｎｅｒ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ— ｇｙ，２００８，２６（６）：３２１—３２７． Ｘ Ｗｕ，Ｃ Ｈｕａｎｇ，Ｑ Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎｏｖｅｌ ｌａｃｃａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏｗａｒｄｓ ＨＩＶ－Ｉ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｐｒｏ— ［１２］ ｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｏｆ ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｒｏ－ ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２０１４，２８（４）：５４８—５５３． Ｍ Ｍｕｋｈｅｄｅｅ，Ｐ Ｋ Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｂ Ａ Ｈｏｒｗｉｔｚ，ｅｔ ａ１．Ｔｒｉｅｈｏｄｅｒｍａ－ｐｌａｎｔ－ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｉｏ— ［１３３ ｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．Ｉｎｄｉａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，５２（４）Ｉ５２２—５２９． ［１４］ Ｔ Ｋｕｄａｎｇａ，Ｍ Ｌｅ Ｒｏｅｓ—Ｈｉｌ１．Ｌａｃｅａｓｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｆｕｅｌｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，９８（１５）：６ ５２５—６ ５４２． ［１５３ Ｃ Ｐｅｚｚｅｌｌａ，Ｌ Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｐｉｓｃｉｔｅｌｌｉ Ａ．Ｈｏｗ ｔｏ ｅｎｊｏｙ ｌａｃｃａｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５，７２（５）：１－１８． Ａ Ｐ Ｓｉｎｇｈ，Ｔ Ｓｉｎｇｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｗｏｏｄ—ｒｏｔｔｉｎｇ ｆｕｎｇｉ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｓｓ＆Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ，２０１４，６２： ［１６３ １９８—２０６． Ｌ Ｌ Ｋｉｉｓｋｉｎｅｎ，Ｍ Ｒｈｔｔ６，Ｋ Ｋｒｕｕｓ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｌａｃｃａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｐｐｌｉｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｔ ［１７］ ２００４，９７（３）：６４０－６４６． 林俊芳，刘志明，陈晓阳，等．真菌漆酶的酶活测定方法评价［Ｊ］．生物加工过程，２００９，７（４）：２－７． ［１８］ 王广慧，戴明，魏雅冬．真菌液态发酵产漆酶的培养条件优化研究进展［Ｊ］．造纸科学与技术，２０１２（６）：９２－９７． ［１９］ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌａｃｃａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ ＣＨＥＮ Ｓｈｏｕ—ｊｕ，ＬＩ Ｓｏｎｇ，ＣＨＥＮ Ａ—ｎａ，ＴＡＮＧ Ｗｅｎ－ｊｉｎｇ，ＬＩＵ Ｙｕ，ＴＡＮＧ Ｂｉｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｎｈｕｉ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈｕ ２４１０００。Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：：Ｌａｃｃａｓｅｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ｇｒｅｅｎ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｏｆｇｒｅａｔ ｂｉ０ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｈａｖｅ ｗｉｄｅｌｙ ｂｅｅｎ ｐａｉｄ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏ．Ａ ｌａｃｃａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｇｕａｉａｃｏｌ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｒｅ— ａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ ｂｙ ｍｙｃｅｌｉａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒＤＮＡ—ＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｉｎ ｆｌａｓｋ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｈｓｓ－ ｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｓ ｎｅｗ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ：ｓｕｃｒｏｓｅ ２５ ｇ／Ｌ，ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ ｊｕｉｃｅ ８０ ｇ／Ｌ，ａｍｍｏｎｉｕｍ ｔａｒｔｒａｔｅ １０ ｇ／Ｌ，ｂｅａｎ ｐｕｌｐ１８ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ２， ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６，ＣａＣＩ２・２Ｈ２Ｏ ０．８，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．２５（１ ｍＭ）ａｎｄ ｔｈｅｉｎｉｔｉａｌ ＰＨ ５．５～６．５．Ａ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ５７１．３２ Ｕ／Ｌ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌａｃｃａｓｅ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ