ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＭＡＴＥＲＩＡ ＭＥＤＩＣＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ２００８ ＶＯＬ．１９ ＮＯ．１０ 时珍国医国药２００８年第１９卷第１０期 脑宁康颗粒对脑缺血预适应 大鼠ＨＳＰ７０表达影响的实验研究 刘爱华，魏江磊 （上海中医药大学附属曙光医院，上海２０００２１） 摘要：目的观察中药脑宁康（ＮＮＫ）颗粒对经脑缺血预适应（ＩＰＣ）处理后大鼠ＨＳＰ７ｏ表达的影响。方法根据Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ 四管法及Ｌｉｕ法分别制作大鼠ＩＰＣ及脑缺血再灌注（ＩＲ）模型，应用免疫组化ＳＰ法作ＨＳＰ 。染色，比较ＮＮＫ颗粒对ＩＰＣ 和ＩＲ两种模型大鼠ＨＳＰ 表达的影响，并以阿斯匹林作对照。结果ＮＮＫ在两模型中均可使ＨＳＰ，。表达明显增强（Ｐ＜ ０．０５～０．０１），且效应显著高于阿斯匹林（Ｐ＜０．０５），但两模型之间比较无显著性差异。且ＮＮＫ能够延缓ＨＳＰ７０表达强度 的减弱。结论ＮＮＫ颗粒通过增强ＩＰＣ和缺血状态中ＨＳＰ 表达，扮演了强化ＩＰＣ及药物预适应角色，旨在增加脑神经细 胞对缺血、缺氧的耐受力，并通过对ＨＳＰ 的干扰，获得稳定神经细胞结构，维护其正常功能的药理效应。 关键词：脑宁康颗粒；缺血预适应；脑；ＨＳＰ７０ 中图分类号：Ｒ２８５．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—０８０５（２００８）１０—２５０５－０２ Ｔｈｅ Ｅｆｌｆｅｃｔ ｏｆ Ｎａｏｎｉｎｇｋａｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｏｎ ＨＳＰＴｏ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒａｔｓ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｐｒｅｃｏｎ－ ｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ＵＵ Ａｉ—ｈｕａ．ＷＥＩ Ｊｉａｎｇ—ｌｅｉ （ｓｈｕ ｇｕａｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ ｔｏ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴＣＭ，２０００２１） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎａｏｎｉｎｇｋａｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ７０ＫＤａ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＨＳＰ７ｎ）ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｔｓｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｒａｔｓ ＩＰＣ ａｎｄ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（ＩＲ）ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ｍａｄｅ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ ｆｏｕｒ ｔｕｂｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＳＰ７ｏ ｉｎ ｔｗｏ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＩＰＣ ａｎｄ ＩＲ ｗｅｒｅ ｃｏｒｎ— ｐａｒｅｄ ｂｙ ＮＮＫ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｐｐｌｙｉｎｇ ＳＰ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＮＮＫ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ＨＳＰ７０ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＰＣ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｐｌａｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ Ｏｆｆ ｓｔｒｏｎｇｉｎｇ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＰＣ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮＮＫ ｐａｒ— ｔｉｃｌｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌｓ ｆａｃｉｎｇ ｔｏ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＮＮＫ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｌｓｏ ｃａｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｗｉｔｈ ＨＳＰ７０ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｋｅｅｐ— ｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎ ｎｏｒｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＮＮＫ ｐａｒｔｉｃｌｅ； Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ； Ｂｒａｉｎ；ＨＳＰ７ｏ 近年来，脑缺血预适应（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ＩＰＣ）过程 东中医药大学附属制剂厂生产，生药含量为５ ｇ／ｇ；肠溶阿斯匹 中产生的机体重要保护因子热休克蛋白（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ， 林（ＡＳＰ）为沈阳克达药厂生产，批号９７０２０８。 ＨＳＰ）已引起广泛关注。对整体和离体经应激作用后的细胞或组 １．３动物雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠４８只，平均体质量（３００±３０）ｇ，由 织的研究表明 ，当细胞受到损伤时，均伴随ＨＳＰ含量增加。因 山东医科大学实验动物中心提供。 而，普遍认为ＨＳＰ的功能主要是在于稳定细胞的结构，从而维护 ２方法 细胞的正常生理功能。在脑缺血损伤领域的研究显示，ＨＳＰ具有 ２．１模型制备与取材 保护脑细胞，增加脑细胞对缺氧的耐受性，明显降低神经元对谷 ２．２分组Ｗｉｓｔａｒ鼠４８只，用随机数字表法将动物随机分为模 氨酸毒性作用的敏感性 ，从而抵抗神经元进一步致死性损伤 型组（ＭＯＤＥＬ）、假手术组（ＦＯ）、ＡＳＰ组和ＮＮＫ组，每组均按 的作用。本研究拟观察ＨＳＰ 。在ＩＰＣ和脑缺血再灌注（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ＩＰＣ方法和ＩＲ方法制模，共８组，每组６只。 ｒｅｐｅｆｒｕｓｉｏｎ，ＩＲ）中的表达及脑宁康（ＮＮＫ）对其的影响。现报道 ２．３模型制备 如Ｆ。 ２．３．１ ＩＰＣ模型制备ＩＰＣ模型根据Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ四管法及“ｕ １材料与仪器 法 制备。戊巴比妥钠５０ ｍｇ／ｋｇ经腹腔注射麻醉，颈部正中线 １．１仪器多功能显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ一２６９８６５，ＪＡＰＡＮ），电镜 纵行切口，分离暴露第１颈椎，寻找双侧翼小孔，电灼封闭双侧 （ＪＥＭ一１２００ＥＸ，ＪＡＰＡＮ），医用低温冷冻冰箱（ＳＡＮＹＯ，ＪＡＰＡＮ）， 椎动脉。翻转体位，颈部纵行切口，分离暴露双侧颈总动脉约 电子蠕动泵（ＬＤＢ—Ｍ）。 ２ｃｍ，４号手术线牵引。头部正中切口，顶部钻孑Ｌ，埋藏微电极， １．２试剂与药品鼠抗ＨＳＰ 单克隆抗体（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａ— 齿科水泥固定。动脉夹夹闭两侧颈总动脉，造成全脑缺血，微电 ｔｉｏｎ，ＵＳＡ），链卵白素一生物素结合辣根过氧化酶，１：３００ｚｙｍｅｄ， 极连接八道生理仪观察脑电图，验证缺血效应。缺血３ ｍｉｎ后， ＵＳＡ），染色试剂盒（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）。ＮＮＫ颗粒由山 松开动脉夹，恢复供血，缝合皮肤，按成人剂量７倍分别给予 ＮＮＫ组及ＡＳＰ组相应药物。２４ ｈ后，再次夹闭两侧颈总动脉３ ａｒｉｎ。假手术组依上法操作，但不封闭及夹闭椎动脉、颈总动脉。 收稿日期：２００７－０９４３５； 修订日期：２００８４３５－２０ 各组饲以标准合成饲料，自然饮水。 作者简介：刘爱华（１９７７一），女（蒙古族），内蒙古乌兰浩特人，现为上海中 ２ ＩＲ模型制备ＩＲ模型制备方法同』二，但不进行两次３ ｍｉｎ 医药大学在读博士研究生，硕士学位，主要从事中西医结合脑病临床专科 ２．３．缺血预适应处理，服药时间与ＩＰＣ模型同步。在ＩＰＣ模型第２次 研究工作． ・２５０５・ 时珍国医国药２００８年第ｌ９卷第１Ｏ期ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＭＡＴＥＲＩＡ ＭＥＤＩＣＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ２００８ ＶＯＬ．１９ ＮＯ．１０ 短暂缺血后７２ ｈ，除假手术组外的其余６组均再次夹闭颈总动脉 备测。 １０ ｍｉｎ，并于缺血再灌注２４ ｈ后取血备测。 ２．５统计方法采用ＳＰＳＳ１２．０统计分析软件，实验数据用 ± ２．３．３取材分别于ＩＲ后２４，７２ ｈ，戊巴比妥钠５０ ｍｓ／ｋｇ麻醉 表示，显著性检验用配对ｔ检验或方差分析，Ｐ＜０．０５为有统计 大鼠，开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，通过ＬＤＧ—Ｍ型电子 学显著性。 蠕动泵，快速灌入肝素化生理盐水（２万ｕ／１００ｍ１）１００ ｍｌ，随后用 ３ 结果 ４％多聚甲醛磷酸缓冲液４ｏＣ，ｐＨ ７．４，２００ ｍｌ，灌注１ ｈ，立即冰台 ＮＮＫ对ＨＳＰ，。表达的影响见表１。由表１可见：①皮层结构 取脑，分离皮层组织块，动存于一７０￣Ｃ冰箱，用于检测ＨＳＰ 表 中，再灌注２４ ｈ、假手术组未见明显ＨＳＰ 阳性信号；ＩＰＣ模型组 达。另一部分组织块用０．１ Ｉｌｌ的磷酸缓冲液配制的１％饿酸溶 及再灌注模型组均可见ＨＳＰ 阳性信号，但前者阳性细胞数量及 液（ｐＨ ７．４）固定２ ｈ，ＰＢＳ充分洗涤，１％饿酸溶液后固定，４℃，递 染色深度明显强于后者（Ｐ＜０．０５），提示经ＩＰＣ处理后，ＨＳＰ 。表 增浓度的酒精脱水，ＥＰＯＮ８１２包埋液浸透，包埋。切片用醋酸钠 达明显增加。②以ＮＮＫ及阿斯匹林干扰后发现，ＮＮＫ在两模型 和枸橼酸铅染色，半薄切片定位，超薄切片，ＴＥＭ一１２００ＥＸ透射 组中均可使ＨＳＰ 表达明昆增强（Ｐ＜０．０５～０．０１），且效应显著 电镜观察。 高于阿斯匹林（Ｐ＜０．０５），提示ＮＮＫ能积极干扰ＨＳＰ 诱导程 ２．４ ＨＳＰ，。检测方法根据匡式法，组织标本冰冻切片上行３０ 序。③模型间比较，ＮＮＫ对ＨＳＰ 。的影响虽以ＩＰＣ模型稍强，但 ｍ连续冠状切片。室温下，２％ＴｒｉｔｉｏｎＸ一１００液中孵育４０ ｍｉｎ， 无明显差异（Ｐ＞０．０５）。提示ＮＮＫ既可能在ＩＰＣ过程中有诱导 。表达效应，亦可能在缺血再灌注损伤中扮演药物预适应角 切片浸入鼠抗ＨＳＰ７０单克隆抗体孵育４８ ｈ，４ｏＣ。抗体用１％血 ＨＳＰ 清白蛋白磷酸缓冲液配制，经ＰＢＳ洗涤１０ ｍｉｎ，浸入生物素结合 色。④从不同时期ＨＳＰ 。表达强度分析中发现与２４ｈ时相比较， 兔抗鼠ＩｇＧ，室温下孵育２ ｈ，再经ＰＢＳ洗涤，切片浸入链卵白素 ７２ ｈ时相其表达强度明显减弱（Ｐ＜０．０５），但ＮＮＫ可以延缓这 一一生物素结合辣根过氧化酶孵育２ ｈ（室温）。ＰＢＳ充分洗涤， 一过程（Ｐ＜０．０５）。提示ＮＮＫ颗粒在诱导和调控ＨＳＰ７。表达方 加１～２滴ＤＡＢ色素于Ｃ：Ｈ，２Ｏ 梯度脱水，透明，Ｄ—Ｐ—Ｘ封片 面均有药理效应。 表１ ＮＮＫ颗粒对模型ＨＳＰ７。表达的影响（ｘ±ｓ） ｊ ＭＯＤＥＬ比较， Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．Ｏｌ；与ＡＳＰ比较， Ｐ＜０．０５；与７２ｈ比较， Ｐ＜０．０５；与ＩＲ比较， Ｐ＜０．０５；ｎ＝６ ４讨论 ７２ ｈ ＨＳＰ７ 表达强度明显弱于２４ｈ时相，而ＮＮＫ可使７２ ｈ时相 。减弱幅度变小，提示该药在调控ＨＳＰ 。表达方面有药理效 热休克现象是Ｒｉｔｏｓｓａ在观察果蝇幼虫唾液腺细胞染色体在 ＨＳＰ ＰＣ过程中ＨＳＰ 的表达，使得在缺血状态 过热过程中形态变化时首先发现的。后来，Ｔｉｓｓｉｅｒｅｓ等发现，染 应。由于ＮＮＫ干扰了Ｉ色体的膨突与细胞中的蛋白质合成有关，故称其为热休克蛋白 中ＨｓＰ７ｎ对皮层神经细胞的保护作用增强，因而获得了较优的治 ＰＣ状态中抑制或缺血再灌注 （Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）。生物体受外界环境的应激作用诱导 疗效应。综上所述，ＮＮＫ不论住Ｉ产生的ＨＳＰ组分较为复杂，不仅能产生分子量相差很大的ＨＳＰ， 状态中均能使ＨＳＰ 表达增强，扮演了强化ＩＰＣ及药物预适应角 缺氧的耐受力，并通过对ＨＳＰ 。 也能产生几个在分子量上十分接近的ＨＳＰ。哺乳动物以ＨＳＰ 。家 色，旨在增加脑神经细胞对缺血、获得稳定神经细胞结构，维护其正常功能的药理效应。 族为主。热应激、缺血／缺氧、氧自由基等均是重要的诱导冈素。 的干扰，近年来，ＨＳＰ在缺血预适应（ＩＰＣ）过程中的脑保护作用已经被广 泛认可，之前大多认为其保护大脑的机制是由于ＨＳＰ 。的伴侣作 用。而最新报道认为，ＨＳＰ 。也能够调节炎症反应，从而显示出其 ［１］任惠民，周兆年．稳定细胞结构的分子基础：热休克蚩门［Ｊ］．生理 脑保护的作用。 科学进展，１９９４，２５（１）：１１． 本研究结果表明，分别经ＩＰＣ处理及缺血６ ｍｉｎ再灌注２４ ｈ ［２］Ｒｏｄｏｒｆ Ｇ，Ｋｏｒｏｓｈｅｔｚ ＷＪ，Ｂｏｎｖｅｕｔｒｅ ｊｖ．Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｓｔｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｕｒｏｕｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｎ，１９９１，７：１０４３． 后，两模型组Ｗｉｓｔａｒ鼠大脑皮层结构中均有ＨＳＰ 。表达，而以前 Ｌ ｉｕ Ｙ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄａｍａｇｅ 者为强。ＮＮＫ颗粒干扰后，两组ＨＳＰ 表达明显增强，提示ＮＮＫ ［３］ｂｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｕｂｌｅ ｔｈａｔ ｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，１ ９９２，５８６ 既有可能诱导ＨＳＰ 。表达效应，同时也可能在缺血再灌注损伤中 参考文献： 发挥药物预适应作用。不同时相ＨＳＰ 。表达强度分析显示，缺血 （１）：１２１． ・２５０６・