猪卵母细胞体外成熟技术研究进展

安徽农业科学。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｎｈｕｉ　Ａｍｉ．Ｓｃｉ．２００６，３４（２１）：５５５６—５５５８，５５６０　责任编辑孙红忠责任校对孙红忠　猪卵母细胞体外成熟技术研究进展　项智锋，李艳，王清华（河南科技学院动物科学学院，河南新乡４５３００３）　摘要猪卵母细胞体外成熟（ⅣＭ）为猪胚胎的体外生产及相关胚胎工程技术如胚胎细胞和体细胞核移植、转基因和性别控制提供了廉　价原料，是现代胚胎工程技术的研究热点之一。多年来科研人员为了进一步提高卵母细胞体外培养成熟率以及更深入地了解卵母细胞　成熟机制，对影响卵母细胞体外成熟的因素进行了大量的研究。综述了影响猪卵母细胞体外成熟的相关因素。　关键词体外成熟；卵母细胞；胚胎工程　中图分类号￥８１４．６　文献标识码Ａ　文章编号０５１７—６６１１（２００６）２１—５５５６—０３　猪卵母细胞体外成熟培养技术是现代生物技术中的重　要内容之一。猪卵母细胞体外成熟是体外受精、性别控制、　核移植技术等成功与否的前提和关键。最早进行哺乳动物　卵母细胞培养的是Ｐｉｎｃｕｓ和Ｅｎｚｒｏａｒｍ，他们从兔卵巢中取出　未成熟卵母细胞进行培养，并且获得了成功。自从１９６５年　Ｅｄｗａｒｄｓ首次将小鼠、绵羊等动物的卵母细胞在体外培养成　熟后，科研人员对多种哺乳动物卵母细胞的成熟培养及成熟　过程进行了深入的研究，以期能获得更高的卵母细胞成熟　率。笔者结合国内外学者的相关研究，对影响猪卵母细胞体　外成熟培养的有关因素进行了综述。　１猪的品种　猪的不同品种，其卵母细胞质量不同，体外成熟培养效　果不同，如瘦肉型猪与非瘦肉型猪，巴马香猪与本地猪，外国　品种与国内品种。即便是国内不同省份的品种，也可能因遗　传背景、特定营养环境、气候条件的不同造成品质上的差异，　导致卵母细胞质量的差异。　２猪的年龄及健康状况　近几年的研究发现，经产母猪卵母细胞在成熟率及胚胎　发育能力方面明显优于青年母猪＿ｌ　Ｊ。处于不同的发育阶段　如仔猪、处女猪、经产猪、老母猪能够影响猪胚胎体外生产的　效率，不同年龄的猪也会影响卵母细胞成熟培养的效果。因　为，其卵巢外观不同，抽取的卵母细胞成熟培养效果也不同。　有的育龄盛期的母猪，其卵巢较大，有黄体，颜色较深，表面　卵泡多而且大卵泡比例高，获得的卵母细胞细胞质较均匀。　而有的猪的卵巢很小，还没有黄体，颜色很浅，都是极小的卵　泡，获得的卵母细胞细胞质不太均匀，局部有较多稀薄空洞　结构。如果卵巢质量好，卵母细胞质量就好，体外成熟也较　好。猪的健康状况也影响猪卵母细胞体外成熟　健康母猪　的卵母细胞，体外成熟效果好，而源于老弱病残母猪的卵母　细胞体外成熟效果差。　３猪的性周期阶段　卵巢所处不同性周期阶段如无黄体期时卵母细胞体外　成熟率优于黄体期和黄体前期卵巢上卵母细胞成熟率。郭　宪等Ｉ２］的试验结果证明：无黄体期卵母细胞成熟率（６９．２％）　高于黄体期（６４．３％），但两者差异并不显著，说明卵巢性周　期阶段对猪卵母细胞成熟有影响，但影响不大。原因可能是　在体外成熟培养时所选用的卵丘一卵母细胞复合体都是胞　基金项目　河南科技学院引进人才基金项目。　作者简介　项智锋（１９７８一），男，湖北武穴人，硕士，助教，从事动物胚胎　工程研究。　收稿日期　２００昏Ｏ６．ｏ７　质均匀、卵丘层２层以上，卵母细胞在体内发育的阶段相似，　因此无黄体期和黄体期两者无显著差异。　４卵巢保存温度及时间　　．卵巢长时间在体外环境中保存，会阻碍蛋白质的合成，　并抑制卵母细胞生发泡破裂，延迟卵母细胞的成熟。因此从　屠宰场获取的卵巢，要用０．９％的生理盐水或含抗生素的磷　酸缓冲液保存在尽可能短的时间内运回实验室。卵巢的保　存温度及贮存时间影响卵母细胞的体外成熟。Ｗａｌｔｅｒ和　Ｇｒａｙｅｓ研究了不同保存温度（５、１６、２５、３０和３７　ｑｃ）及不同贮　存时间（２，６、１０、１４和２６　ｈ）对猪卵母细胞体外成熟的影响，发　现不管采用哪种温度，随着贮存时间的延长，卵母细胞的成　熟率下降＿３　Ｊ。而Ａｂｅｙｄｅｅｍ认为采用２５　ｑｃ运输，５　ｈ内对卵母　细胞成熟及发育能力没有影响＿４　Ｊ。一般认为卵巢自体内取　出后，采用２５～３７　ｑｃ贮存，短时间内将卵巢运回实验室对卵　母细胞体外成熟影响不大。　５卵母细胞采集方法　卯母细胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在从离体卵　巢上采集卵母细胞时，因采集方法不同，所得卵母细胞体外　成熟率间存在一定的差异，如抽吸法成熟率（７７。６％）低于切　剖法（８ｏ。４％）。抽吸法和切剖法相比两者各有优缺点。与　抽吸法相比，切剖法虽然费时，但极少破坏卵丘一卵母细胞　复合体（ＣＯＣｓ），这种采集方法更有利于ＣＯＣｓ的生长发育＿５　Ｊ。　注射器抽取有腔卵泡比用刀片割破所取卵母细胞较少，但是　符合取卯时间愈短愈好的原则，因其方便、干净、简捷被普遍　使用。但要注意选择合适的注射器和针头。通常１０｜ｌ１ｌ注射　器加１８号针头是比较合适的。实践发现１０｜ｌ１ｌ注射器实用　操作性比５和２０｜ｌ１ｌ的好，抽取卵泡的速度也比较快，特别是　针头的大小非常重要。针头太大，卵母细胞流失很多，没有　足够数量的卵母细胞进行实验；针头太小则抽取过程中卵丘　细胞会大量的脱落，因为卯丘细胞对卵母细胞有重要的协同　作用，卵丘细胞的脱落将不利于卵母细胞的体外成熟。　６卵泡的直径　哺乳动物的卵巢上存在２种卵泡，一种为有腔卵泡，另　一种为腔前卵泡。已有研究表明，腔前卵泡卵母细胞的体外　成熟率（２６．１％）显著低于有腔卵泡卵母细胞的体外成熟率　（８３．０％）。由于ＲＮＡ的早期合成和积蓄是卵母细胞成熟分　裂和早期胚胎发育的物质基础，小腔卵泡卵母细胞成熟率低　于一部分正进行ＲＮＡ的合成、未能适时适量地合成某些参　与调控成熟分裂恢复的蛋白因子有关，而大卵泡内已存了足　够的ＲＮＡ以合成蛋白质且大腔卵泡卵母细胞处于快速生长　后期，细胞内转录已完成，在体外具有自发核成熟能力，故成　维普资讯 http://www.cqvip.com

３４卷２ｌ期　项智锋等猪卵母细胞体外成熟技术研究进展　５５５７　熟率高。卵母细胞只有达到一定体积才具有恢复减数分裂　的能力，来自小腔卵泡的卵母细胞在核成熟方面存在缺陷，　故有腔卵泡直径大小对猪卵母细胞体外成熟和发育也有影　响。Ｙｏｏｎ等¨６　研究发现，来自３　８　ｎⅡｎ直径卵泡的卵母细胞　细胞的成熟以及降低胚胎发育能力，并认为石蜡油或矿物油　可能含有对卵母细胞生长不利的物质。　不同动物卵母细胞最适宜培养温度不同，但是卵母细胞　体外成熟的最佳温度应是动物的体温。一般来说，稍高一点　成熟率显著高于小于３ＩＴＵＴＩ的卵泡卵母细胞（９１％：５８％）。韩　毅冰等ｌ　７＿也证明小直径卵泡卵母细胞（＜１～２　ｍｍ）成熟率不　如大直径卵泡卵母细胞（２—６　ｉ＇Ｉｇｎ）。通过对不同大小卵母细　胞和来自不同卵泡的卵母细胞体外培养发现，卵母细胞大小　对穿卵率无影响，但卵泡大小同穿卵率正相关［８３。　７卵丘卵母复合体类型　的温度对细胞易造成损害，而稍低于体温的温度对体外成熟　似乎无甚影响。目前，猪卵母细胞ＩＶＭ时采用的温度为３８．５　—３９℃。为保持培养的气相、湿度、温度的相对稳定，将培养　皿或培养板置于培养箱的内部，可以一定程度地缓解由于其　他操作打开Ｃ０２培养箱对卵母细胞培养产生的不利影响。　８．４培养体系　在卵母细胞体外成熟研究中，一般根据卵母细胞周围包　绕卵丘细胞的情况，分为４种类型：即包绕３层以上紧密卵　丘细胞的卵母细胞为第１类；３层以下的为第２类；卵丘细胞　扩展而疏松，卵母细胞卵质无斑块的为第３类；无卵丘细胞　的卵母细胞（裸卵）为第４类。李丽立等［９３对这４类卵母细　胞体外成熟研究结果表明，达到ＭＩＩ期的成熟率分别为　９３％、９ｏ％、７６％、２０％，成熟效果依次递减。因为在哺乳动物　卵母细胞成熟研究中发现，处于静止期的初级卵母细胞在激　素的作用下，若没有卵丘细胞的存在则卵母细胞不能成熟。　可见在卵母细胞成熟发育时卵丘细胞直接向卵母细胞发出　成熟发育信息。卵丘细胞对卵母细胞有着重要的协同作用，　所以卵丘的完整性和卵丘细胞包绕情况对卵母细胞成熟具　有重要的作用。因此，在进行猪胚胎体外生产时多选择卵母　细胞胞质均匀、透明带完整、具有３层或３层以上卵丘细胞　的ＣＯＣｓ进行培养ｌ＿４Ｊ。　８卵母细胞体外培养条件　８．１气相条件　目前，卵母细胞常用的培养气相有２种，一　种是５％ｃｏ２，５％ｏ２，９０％Ｎ，；另一种是５％ｃｏ２，９５％的空气。　在这２种气相中，Ｃ０２的含量十分关键。因为培养体系内　ｃ０２不仅可以平衡培养基，而且还有助于细胞代谢中的丙酮　酸转换成草酰乙酸，有利于细胞成熟。多数培养基在配制前　都已将ｐＨ值调好，并具有一定的缓冲能力，５％ｃｏ２则刚好　是维持ＤＨ所必需的。　８．２培养时间其他哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时间　通常是２２　２４　ｈ。但是猪比较特殊，通常需要４８　ｈ左右才能　达到核成熟，在２４　ｈ的核成熟率几乎为零，而且从３０　ｈ左右　到７２　ｈ，核成熟率几乎是随着培养时间的增加而直线上升。　虽然延长培养时问可以使核成熟率逐步增高，但是猪的卵母　细胞会逐渐老化，因此在保证一定的核成熟率的前提下，有　必要缩短猪卵母细胞体外成熟培养时间。体外培养是建立　于猪卵母细胞在促黄体素（ＬＨ）峰值出现后３６　４２　ｈ达到成　熟这一基础上。目前国内多采用４８　ｈ，世界首例转基因克隆　猪的成熟培养时间选择４２～４４ｈ。　８．３培养温度和湿度在体外成熟（ＩＶＭ）时采用的是饱和　湿度，目的是减少培养基的水分蒸发，维持培养基中各种物　质的浓度，保持渗透压。各种物质浓度的变化及渗透压的变　化会造成猪卵母细胞的生发泡破裂。因此，通常在培养基上　面覆盖一层石蜡油或矿物油，以使在培养箱内或离箱操作时　维持培养基的气相、湿度及ｐＨ值。但Ｓｈｉｍａｄａ等ｌ１　０ｌ研究发　现，石蜡油或矿物油对类固醇激素具有吸附作用，延迟卵母　８．４．１基础培养基。卵母细胞体外成熟的基础培养基有２　种：一种是含有能量物质的简单盐溶液培养基，如Ｗｈｉｔｔｅｎ　ｍｅｄｉｕｍ；另一种是复合型组织培养基，含氨基酸、维生素、核　酸前体等物质，成分复杂，如ＴＣＭ１９９Ｅ　。培养基要求ＤＨ值　在７．２—７．４，渗透压在２６０　３２０ｍｏｓｍ／ｋｇ，偏离此范围对卵母　细胞生长是有害的。目前大多数学者采用ＴＣＭ１９９和ＮＣ—　ＳＵ２３。虽然这２种培养基在卵母细胞成熟率上差异不显著，　但受精后胚胎发育能力ＮＣＳＵ２３培养基占明显优势¨ｌ１２＿２。　８．４．２激素。在体内，卵母细胞胞质的成熟过程受激素水　平的调节，排卵前促性腺激素峰可以通过颗粒细胞诱导卵母　细胞成熟，并引起卵丘细胞扩散。因而促性腺激素水平的变　化对卵丘细胞的分泌功能具有一定的调节作用，卵丘细胞受　激素作用的时问由此也可能直接或者间接地影响卵母细胞　的核和胞质的成熟。促性腺激素被认为对成熟的启动发挥　重要作用，一般成熟培养液都要添加。目前。成熟培养液中　使用较多的促性腺激素是ＦＳＨ和ＬＨ。ＦＳＨ和ＬＨ作用于生　长至一定程度的卵泡时，可使卵丘细胞扩散，中断与卵母细　胞之间的联系，使卵丘细胞的信息不能传入卵母细胞，从而　解除了卵丘细胞对卵母细胞恢复减数分裂的抑制作用，使卵　母细胞减数分裂重新启动。虽然ＦＳＨ和ＬＨ在猪卵母细胞体　内成熟和排卵中起重要作用，但似乎ＰＭＳＧ、ｈＣＧ对促进体外　成熟更为有效。早期研究中，促性腺激素存在于整个培养过　程，但是蔡令波等Ⅲ１　３ｌ的研究表明，在猪卵母细胞ＩＶＭ时，培　养前２０　ｈ加入ＰＭＳＧ、ｈＣＧ、雌二醇（Ｅ＇），而在培养后２０　ｈ去　除，可增加卵母细胞的成熟率，促进卵母细胞减数分裂和胞　质成熟。因此，目前绝大多数研究者都采用了此方案。但对　类固醇激素的使用目前还存在争议。Ｍａｒｇｏｔ等¨１　通过研究　发现培养过程中添加雌激素、孕酮等类固醇激素对ＣＯＣｓ的　体外成熟无影响，ＣＯＣｓ培养时能自身合成和分泌上述激素，　满足卵母细胞生长需要，因此建议在培养过程中无需加入类　固醇激素。　８．４．３嘌呤类。环一磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）在哺乳类生长完全的　卵母细胞的减数分裂抑制中起着非常重要的作用。研究表　明次黄嘌呤、腺嘌呤核苷酸在体外和体内均可抑制卵母细胞　的减数分裂。腺嘌呤核苷酸可能通过不同形式的作用影响　ｃＡＭＰ的代谢来调节卵母细胞的减数分裂，其主要途径有２　条：一是通过磷酸化生成ＡＴＰ，然后再经腺苷酸环化酶的作　用转化为ｃＡＭＰ，使细胞内ｃＡＭＰ水平升高；二是刺激卵母细　胞表面的腺苷酸环化酶的活性，提高细胞内ｃＡＭＰ水平，达到　对卵母细胞成熟的抑制。次黄嘌呤除通过调节ｃＡＭＰ的代谢　维普资讯 http://www.cqvip.com

５５５８　安徽农业科学　２００６生　外还可通过影响鸟苷的产量而实现对卵母细胞的成熟抑　制［１５］。　够刺激成熟分裂复始；高浓度的颗粒细胞（５×ｌＯ６—１００×ｌＯ６　／ｒｎ１）则抑制成熟分裂的复始。　８．４．８生长因子和细胞因子。在基础培养基中添加生长因　８．４．４　Ｃａ２　。卵母细胞成熟之前促成熟因子（ＭＰＦ）以无活　性的形式存在，在某些信息作用下，细胞内ｃａ２　水平升高，结　合并激活钙离子载体（ＣａＭ），形成ｃａ２　／ＣａＭ复合物，使ＭＰＦ　处于激活状态，进而促进卵母细胞的成熟分裂。Ｃａｒｒｏｌｌ和　Ｓｗａｒｍ报道，去除培养液中的ｃａ２　或加入ｃａ２　通道阻断剂均　可抑制猪卵母细胞极体的形成。　８．４．５血清。血清成分十分复杂，含激素、生长因子、细胞　因子、氨基酸、酯类、维生素等物质。血清对卵母细胞体外成　子，如胰岛素、表皮生长因子、转化生长因子等对卵母细胞的　生长、成熟起重要的调节作用。如表皮生长因子是一种卵泡　卵母细胞成熟的诱导剂，能促进卵母细胞的体外成熟。Ｈｍ－　ｔｅｌ等［２１］发现，３０　Ｌ的表皮生长因子有利于卵母细胞的体　外成熟，使达到第二次减数分裂中期的卵母细胞达到９７％。　９其他物质　现以证明，成熟液中添加Ｃｙｓｔｅａｍｅ　ｊ、Ｌ－Ｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＢＭＥ（￣　熟的作用，主要是由于血清能为ＣＯＣｓ提供所需的蛋白质，或　者是由于血清与卵母细胞一起能够防止透明带变硬，从而有　利于精子的穿入。在卵母细胞培养时常用的血清种类有胎　牛血清（ＦＣＳ），发情牛血清（ＥＣＳ）和新生犊牛血清（ＮＣＳ），但以　ＦＣＳ应用最广泛。蔡令波等ｌ１３］报道，ＥＣＳ较ＮＣＳ更有利于猪　卵母细胞体外成熟，并认为可能是ＥＣＳ比ＮＣＳ含有更高促陛　腺激素、类固醇激素浓度的缘故。也有学者添加同种动物血　清进行实验，成国祥等就指出，发情山羊血清较ＦＣＳ更有利　于山羊卵母细胞的体外成熟。虽然ｗｕ　Ｊｉ等ｌ】　在进行猪腔　前卵泡和有腔卵母细胞培养时采用了猪血清，但猪血清跟其　他动物血清在促进成熟方面进行比较的报道较少。添加血　清虽能普遍提高卵母细胞的体外成熟率，但血清有其固有缺　点，如一些特性未明成分能够吸附激素、维生素、脂肪酸以及　金属离子，而且还可能存在抗精子抗体，易被支原体污染等。　近几年来，由于无血清培养体系化学成分明确，能够消除因　血清质量及不明成分等带来的不确定因素，便于分析促进卵　母细胞成熟的物质，因此研究较为活跃　】　。　８，４．６卯泡液。猪卵泡液（ＰＦＦ）是猪卵母细胞体外成熟的　主要环境，它是卵泡中血清渗出物经过新陈代谢活动改变过　的产物，包含有特殊成分，如卵泡壁细胞合成的类固醇和糖　蛋白。卵泡液对卵母细胞生长发育有促进作用。Ｙａｓ￣ｄａ　等　】８＿报道在培养基中添加猪卯泡液可显著提高猪卵母细胞　的核成熟率、正常受精率及卵裂率，并发现一种分子量在　１００００—２０００００　Ｄａ的酸性物质促进了卵母细胞成熟。Ｖｍｆｉｓ　等　】９Ｉ研究认为，冷冻卵泡液在促进卵母细胞的成熟、降低多　精受精方面优于新鲜卵泡液，并提出冷冻可能使某些促进卵　母细胞成熟的物质激活或抑制某些对卵母细胞生长不利的　物质。但有的学者报道，在成熟过程中添加卵泡液对卵母细　胞的核成熟及卵裂率无影响，只提高桑葚胚的形成率。由于　卵母细胞在体外具有自发成熟的现象，暗示卵泡液中可能含　有抑制卵母细胞成熟的物质，这些物质只是在某些阶段才被　去除或抑制。已有的研究表明，次黄嘌呤（Ｈｘ）是卵泡液中能　够抑制成熟的主要成分。苏有强等　扣ｊ证明ＨＸ能可逆性地　抑制猪卵母细胞的体外成熟，且该作用具有剂量依赖性。但　不管如何，在培养过程中添加卵泡液对促进卵母细胞成熟及　提高胚胎发育能力的作用已得到肯定。　８．４．７颗粒细胞。卵母细胞周围的颗粒细胞分泌卵母细胞　成熟抑制因子（０ＭＩ），具有抑制卵母细胞的自发成熟作用，但　其作用与细胞浓度有关。低浓度的颗粒细胞（１×ｌＯ６　５×　１０６／ｍ１）在促性腺激素或发情牛或绵羊血清存在的情况下能　ｍｅｗａｐｔ￣ｏｎａ１）ｌ２２　和ＡＡ．２．Ｇ（ＡＳｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ　２－０－２．Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）ｌ２３ｊ　能有效地促进卵母细胞胞质成熟，有利于胚胎生长发育。但　为了探讨更好的成熟体系，许多研究者还采取延迟减数分裂　启动的方法，以使卵母细胞核、细胞质成熟同步化，增加成熟　率。二丁基环一磷酸腺苷（ａｂｃＡｎＰ）为其中研究较多的一种。　ｄｂｃＡＭＰ为减数分裂的抑制物，能延长生发泡期，促进卵母细　胞生发泡破裂同步化，因此在培养后期去除可以显著提高卵　母细胞成熟率　ｊ。　１０结语　卵母细胞的成熟是一个复杂的动态的过程，有许多代谢　事件发生，除了进行积极的ｎ￣ＲＮＡＳ转录、蛋白质合成外，还　有其他一些物质的降解。卵母细胞的成熟包括细胞质的成　熟和细胞核的成熟２个方面。在体外成熟培养中，通常也以　第１极体的排出来判断卵母细胞的成熟，其实这只是核成熟　的标志。只把核成熟作为判断卵母细胞体外成熟的标志，严　格来讲是不全面的。因此除了核成熟外，卵母细胞的胞质成　熟也很重要，尤其是对用于核移植的卵母细胞而言。胞质的　成熟直接关系到能否使供体核实现彻底的再程序化，重构胚　能否维持正常的分裂发育。从这个意义上说，目前所用的卵　母细胞成熟体系还不尽完善，一些对卵母细胞成熟和后续发　育非常重要的物质不能完全合成。而影响猪卵巢卵母细胞　体外成熟的因素很多，使得这一技术在应用时存在一定的难　度和问题。如何建立更佳的体外培养体系以提高卵母细胞　的受精率及胚胎发育能力将是以后研究的重点。　参考文献　［１］ＨＹＵＮＨ，ＬＥＥＧ　Ｓ，ＫＩＭＤＹ，ｄ　ａ１．础　ｔｓ　Ｉｌ】ａｔｕ脚ｉｍｍｅｄｉａ　ａｎｄ　ｃｏｃ￣ｅ　ｄｅｒｌｖ￣ｆｒｔｓ￣ｓｏｗｓ　ｔｓ　ｏｎＳｅｄｅ　０ｐｍ∞ｔ　ｄ∞ｅｄｐｉｇ∞ｌｂｒｙ０ｓ［Ｊ］．Ｔｎｅｒｉ—　ｏｇｅｎｄｏｇｙ，２００３，３８（５）：１５—１６．　［２］郭宪，陈学进，叶荣，等．牛卵巢卵母细胞体外成熟的研究［Ｊ］．甘肃农　业大学学报，２００＃（５）：５０３—５０７．　［３］ＷＡＬＴＥＲＳ　Ｅ　Ｍ，ＧＲＡＶＥＳ　Ｃ　Ｎ．Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ￣ａｎｄ　ｓｔｃｒａｇｅ　∞ｐｅ￣２１ｎｅ　０　［Ｊ］．Ｊ　Ａｎｉｍ　Ｓｄ，１９９８，７６：６９—７２．　［４３　ＡＢＥＹＤＥＥＲＡＬＲ．Ｉｎｆｉｌｒｏ　ｐｒｏｄｕ￣ｏｎ　朗　ｉｎ　ｓ￣ｎｅ［Ｊ］．Ｔｎｅｒｉｏｇｅｎｄｏ一　，２０Ｏ２，５７：２５２—２７３．　［５］陈晓宇，刘东，李青旺，等．猪卵巢卯母细胞的收集和体外成熟培养　［Ｊ］．云南畜牧兽医，２ｏ０２（４）：３９—４１．　［６３　ＹＯＯＮＫＷ，ＳＨＩＮＴＹ，ＰＡＲＫ　ＪＩ，ｄ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｄｐｏｒｃｉｎｅ　ｏｏｃｙｔ￣ｆｒｏｍ　ｐｒｅｏｖｕｌ￣ｏｒｙ　ｆ　ｄ　０ｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｉｚｅｓ　ｅｒ　Ｉｔｌｌｒａｔｉ∞ｉｎ　ｍｅｄｉａ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ￣　ｗｉｔＩｌ　ｆ０ｕｉｌｃＬｄａｒ口１Ｊｊｄｓ［Ｊ］．Ｒｅｐｒｏｄ　Ｆｅｒｔｉｌ　Ｄｅｖ，２Ｏ０Ｏ，１２：１３３一ｌ３９．　［７］韩毅冰，施维民，秦鹏春．猪不同直径卵泡卵母细胞体外培养的成熟　能力［Ｊ］．中国兽医学报，２ｏ０２（２０）：ｌ８３一ｌ８７．　［８３　ＬＵＣＡＳ　Ｘ，ＭＡＲＦＩＮＥＺ　Ｅ　Ａ，ＲＯＣＡ　Ｊ，ｄ　ａ１．Ｉｎｆｌｕｅｎ￣　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｓｉｚｅ∞Ｓｅ　ｐｅｎｅｔｒａｂｉｈ￣　ｉｎｒｍｍｒｅ　ｐｉｇ　ｏｏｃｙｔ￣ｆｏｒ　ｉｎ　ｆｉｌｒｏ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｍ　ａｓｓ．ｄｖ［Ｊ］．Ｔｎｅｒｉ．　ｏｇｅｎｄｏｇｙ，２００３，６０：６５９—６６７．　［９］李丽立，王芳．现代生物技术与畜牧业［Ｍ］．北京：科学出版社，２０Ｏ２：１０　一ｌ２．　（下转第５５６０页）　维普资讯 http://www.cqvip.com

５５６０　安徽农业科学　２ｏ０６年　疗效。该试验以ｕＨ肿瘤小鼠为动物模型观察了牛蒡子醇提　子醇提物能显著抑制瘤体生长并延长小鼠生存时间，表明其　物的抑瘤作用，结果表明，醇提物３个剂量组对小鼠宫颈癌　在活体上具有抗宫颈癌活性，为其进一步的临床研究和应用　的抑瘤率和生命延长率均＞３０％，且有统计学意义，说明牛　提供了科学依据。　蒡子醇提物对小鼠宫颈癌有一定的抗癌疗效。　参考文献　表１　牛蒡子醇提物对荷瘤小鼠肿瘤抑制率的影响　［１］王劲，沙明，杨洪武，等．ＨＰＬＣ法对不同地区商品牛蒡子中牛蒡苷元的　定量分析［Ｊ］．中草药，２ＯＯ３，３４（５）：４６７—４６８．　［２］张涛．牛蒡子不同炮制品中牛蒡苷含量的ＨＰＬＣ测定［Ｊ］．中草药，３５　（４）：４０６—４０７．　［３］王海燕．牛蒡子化学成分研究［Ｊ］．药学学嘏，１９９３，２８（１２）：９１１．　［４］ＡＫＩＨＩＫＯＳ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｏｌｌ　ｍｆｉｅａｎｅ￣ｒｐ￣ｉｓｅ　ｃｒｕｄｅ血驿－ｍｆｉｅａｎｅｅｒｐｒ｛ｇｅａｙ　ｆｒｕｃｔｕｓ　ａｒｅｔｉｉ［Ｊ］　ＦｏｒｅｉｇｎＭｅｄｉｃＡｌ　Ｓｄ－Ｔｒａｄｉｉｔｏｎａｌ（￣ｎｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＨｅｒｂ，　１９８７，９（２）：１１１—１１６．　［５］Ｈ疆ｕ　Ｙｃ，ＣＨＡＮＧＷｃ，Ｈ疆ｕ　ＹＴ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｏ　ｏｘｉｄａｉｔｖｅ　ｄＥ　ｂｙ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｌ￣ｆｒｏｍＡｎｔｒＭ／ａ　ｃ口川砷　ｍｙｅｄｉａｉｎｎ｛￣ｍｌ　ｈｕｍａｎ目ｙＩ】．ⅡＩ）ｃ　注：与对照组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，下表同。　［Ｊ］．Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０　，７１：４６９—４８２．　［６］ＥＩＣＨ　Ｅ，ＰＥｔＷＺ　Ｈ．Ａｒｃｉｆｇｅｎｉｎ　ａｓ　ａ　ｌｅａｄ　ｓｔｒｕｃＲＬｒｅ　ｆｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔ￣ｓ　ｈｕｒｏｎ　ｉｍ－　表２　牛蒡子醇提物对荷瘤小鼠生命延长率的影响　ｒｒａｍｏｄｄｉｅｉｎｏｅｙ　ｖｉｍ］ｓ　ｔｙｐｅ　ｉｎｔ哗ｒａｓｅ［ＪＪ．Ｊａｕｒａｌ　Ｍｅｄｉｄｎａｌ　Ｏａｅｒｒ／ｓｔｒｙ，１９９６，　３９（１）：８６—９５．　［７］李大亮，宋杨，周慧华，等．牛蒡子水煎液及牛蒡苷、牛蒡苷元体外抗菌　试验研究［Ｊ］．黑龙江医药，２００４，１７（６）：４３３—４３６．　［８］阎凌霄，李亚明．牛蒡子提取物对小鼠免疫功能及血糖的作用［Ｊ］．西　北；骅杂志，１９９３，８（２）：７５—７８．　［９］ＣＨＯ　ＪＹ，ＫＩＭ　ＡＲ，ＹＯＯＥ　Ｓ，ｅ【ａ１．１ｎｍｍｏｎｒｄｕｌａｔｏｒｙ　ｅｆｅｃｔ　ｎ，ａ　Ｈ　ｍ　ｃ０ｍｐ０ｕｎｄ，ｏｎ　ｔｕｒｎｏｕｔ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔ｛ｘ－ａｌｐｈａ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｉｃ咄ｉｄｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，　ａｎｄｌｙｒｒｇｈｏｃｙｔｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｏ［Ｊ］．＇ＩｈｅＰｈｔｍｍｃｅｕｔｉｃａｌ　ＳｏｄｅｔｙｄＪａｐａｎ，１９９９，５１　（１１）：１　２６７—１２７３．　［１０］王小琳，张玉杰，石任兵．正交实验设计优选牛蒡子的提取工艺［Ｊ］．北　以往研究表明，牛蒡子中主要含牛蒡子甙和甙元，在动　京中医药大学学报，嬲，２６（４）：６４—６５．　物体内试验中具有抗肺癌、胰腺癌及白血病作用，与５．ＦＵ、环　［１１］米靖宇，宋纯清．牛蒡子中木脂素类化合物的抗肿瘤及免疫活陛［Ｊ］．　磷酰胺及顺铂合用可减少或阻止抗癌剂抗癌性的增　时珍国医国药，幻　，１３（３）：１６８—１６９．　［１２］孙铁民，梁伟，林莉，等．牛蒡子对癌瘤作用的实验研究［Ｊ］．辽宁中医　加［１卜Ｈ］。牛蒡子醇提物浓度达到１０　ｍｇ／Ｌ时对人体结肠癌　学院学报，２０１￣２，４（４）：３１０．　细胞、直肠癌细胞及肝癌细胞均有抑制和杀伤作用｜１　Ｉ１引。　［１３］郑国灿．牛蒡子提取液的抗癌性研究［Ｊ］．东南大学学报：医学版，　２０∞．２２（５）：３１９—３２２．　但牛蒡子对宫颈癌方面的影响一直未见报道。　『ｌ４１　ＨＩＲＯＳＥ　Ｍ，ＹＡＭＡＧＵＣＨＩ　Ｔ，ＩＩＮ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｌＬ￣ｎ　ｏｉｌ　ＰｎｔＰ－ｉｎ—　化疗、放疗可以杀灭癌细胞，但同时也产生极大的毒副　ｄｕｃｅｄ　ｍａｍｎ￣ｙ，ｃｏｌｏｎ　ａｎｄ　ｐａｎｃｉ＇ｔ￣ｃ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｆｅｍａｌｅ　Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗ　ｌｅｙ　ｒａｔｓ　ａｎｄＭｄＱｘ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｔｘｄｎｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｍａｌｅＦ＇３４４　ｒａｔｓｌＪｊ．Ｃａｎ—　作用，导致病人食欲不振及免疫功能低下，影响进一步的治　ｏ日Ｌｅｔｔｅｒｓ．２０００．１５５（１）：７９—８８．　疗［１１２２。中医在近年来的系统研究中，已逐渐形成了扶正培　］　１ｌ５　ＫＡＩ＇ＯＴ　ＨＩＲＯＳＥＭ，ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ　Ｓ．Ｅｆｅｃｔｓ　ｔｈｅｌｉｇｎａｎ，ｍｅｒｌｉｎ，ｏｎ　１７一ｂｅ．　ｈａ　ｅｔｈｉｎｙｌ　ｓｅｗａｄｉｄ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｏ　ｐ￣ｍｅｏｐｌｓｅｆｉｃ　Ｈｖｅｒ　ｃｅｌｌｆｏｃｉ　ｄｅｖｄｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　ｒａｔｓ　本为主要原则的中医肿瘤防治体系。通过该试验证明，牛蒡　ｌ　Ｊ】．Ａｌｌｔｉｃａｎｏ￣＂Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，１８（２Ａ）：ｌ０５３一ｌ０５７．　（上接第５５５８页）　１９９９，６１：８２８—８３３　［１Ｏ］ＳＨＩＭＡＤＡ　Ｍ，ＫＡＷＡＮ　Ｎ，ＴＥＲＡＤＡＴ．ＩＭａｙ　ｎｕｃｌｅａｒｍ曲ｍ　∞ａｎｄ　ｒｅ—　　ｌｌ８ｌ　ＹＡＳＨＩＤＡ　Ｍ，ＩＳＨＩＺＡＫＩ　Ｙ，ＫＡＷＡＧＬＳＨＩ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｅｃｔｓ　ｐｉｇ　ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ａｃｔｉｎｏ　ｉｎ　ｄｅｖｄｏ￣ｃ０瑚ｐｅ　０ｆ　ｒａｇ　ｏｏｃｙｔｓｅ船ｎ／ｎｅｒａｌ　ｏｖｅｄａｙ　ｉｎ　ｌｆｕｉｄ　ｏｎⅡＨｔＬ】　∞　ｐｉｇ　００ｃｖ【　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｏｌｌ　ｔｈｅｉｒ　ｓｕｈｓｅｑｕｏｎｔ　ｆｅａｉｌｉｚｉｎｇ　ｖｉｔｒｏ　ｒｍｔｕｒａｔｉｎｏｍｅｄｉａ［Ｊ］．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０　，１２４：５５７—５６４．　ａｎｄｄｅｖｄ￣ｘａａｌ　ｃａｐａｃｉｔｙｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ　Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｎｏ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，　［１１］王海，曾申明，朱士恩，等．培养介质、卵丘细胞和卵泡直径对猪卵母　１９９２，９５（２）：４８ｌ一４８８．　细胞体外成熟的影响［Ｊ］．中国畜牧杂志，２０ｒＥ，３８（５）：１５—１６．　１１９】ＧＩ　ＲＣ　，　呱Ｈ　．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐ０ｌｄＩ】ｅ　ｅｕｌａｒ　ｆｌｕｉｄ　［１２］叶华虎，魏泓，陈紧颐．猪卵母细胞在不同培养液中成熟后的发育能　ａｎｄ　ｏｖｉｄｕｃｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｎｏｅｄｍａｄｉａｏｎⅡ旧ｔＬｌ　∞ａｎｄｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｎｏ　０ｆＤ０《℃ｉｒｌｅ　ｏｏｅｙｔｓｅ　力［Ｊ］．第三军医大学与芍艮，２０（１３，２５（６）：５１１—５１３．　ｉｎｖｉｔｒｏｌ　Ｊ１．Ｂｉｄ　Ｒ　，１９９９，８２：５８—６６．　［１３］蔡令波，王锋．猪卵母细胞体外成熟与冷冻保存的初步研究［Ｊ］．南　］苏有强，夏国良，陈勇，等．Ｈｘ对猪卵母细胞体外自发成熟抑制作用　京农业大学学报，２０　，２５（４）：１１６—１１８．　的研究［Ｊ］．畜牧兽医学报，２ＯＯＯ，３１（１）：２２—２７．　［１４］ＭＡＲＧＯＴ　ＡＬＶＥＳ，ＣＨＡＲＬＥＳ　ＧＲ￣ＶＥＳ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｔｅｒｏｉｄ　ｈｏｒｒｎ￣ｅｓ　ｎｏ　［２１］ＨＹＩＴＥＬ　Ｐ，　ｌＥｖＥ　Ｙ．０ｌ叫　ｉｎ　ｃｏｒｔｉｃａ１．ａ／ｉｕｌｓｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐ０　ｎｅ　ｏ３￣ｙｔｅ　ｉｎ　ｉｖｔｒｏ　ｌｌ／ａｇｌｌＦ￣ｏｎ　０ｆ　ｐｉｇ　ｏｏ￣Ｔｔｓｅ［Ｊ］．＇Ｉｈｅｒｉｏｇｅｎｄｏｇｙ，　，５７：８１１—８２１．　ｍａｔｕｒａｉｆｎｏ［ＪＪ．　ｅ　Ｒｅｓ，１９９９，１１（３）：３３ｏ一３３２．　［１５］黄志坚，黄依明．牛体外受精技术研究进展［Ｊ］．福建畜牧兽医，２０　［２２ｌ　ＡＢＥＹＤＥＥＲＡ　ＬＲ，ⅥＡＮＧ　ＷＨ，ＣｏＮⅡＥＹＴＣ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ　０ｆ　ｌｍ—　（１）：５６—５８．　ｅａ￣ａｈａｎｄ　ｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｄｍ　０ｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　０ｆｒａｇ　００ｃｙ［ｅ　ａｆｔｒｅｉｎｖｉｔｒｏｆｒｅ－　［１６Ｊ　ＪＩ　ＷＵ，ＢＥＮ　ＪＡＭＩＮ，ＤＯＮＧＬＡＳ　ＣＡＲＲＥＡ．Ｉｎ　ｉｖｔｒｏ　ｈ，ｍ址ｕ　∞，ｆｒｅ－　ｔｉｌｉ￣ｏｎ：Ｍｅｖａｎｃｅｔｏｉｎｔｒａ￣ｕｌａｒｇｌｕｔａｔｈｉｎｏｅ［Ｊ　Ｊ．ＢｉｌｏＲｅｐｒ０ｄ，１９９８，８５：２１３　ｔｉｌｉｇ￣ｏｎ　ａｎｄ　出　∞ｉｃｄｅｖｅｌｏｗｃｅｎｔ　０ｆｏｏＬ￣ｅｓｆｒａｎ　呲Ｉ　ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ［Ｊ］．Ｂｉ—　—２１８．　ｏｌ　Ｒ印ｌ珂，２００１，４６：３７５—３８１．　［２３］ＨＩＤＥＫＩ口　ＩＤ，Ⅺ砸ＵＩ　０（　，ＫＯＪＩ　ＳＨＩＣＥ队，ｄ　ａ１．Ｄ　一　［１７］ＹＡＭＡＮＣＨＩ　Ｎ，ＮＡＧＩＡＴ．Ｍａｌｅ　ｌａＸｓａｕｄｅａｒ　ｆｏｒｍａｉｔｎｏ　ｎｏ　ｉｎ　ｄｅｎｕｄｅｄ＇ｃｉｎｅ　ｒｎｅｎｔ　０ｆｄｅｖｄｏｌｘｎｏｎｔａｌ　ｃ　ＨＤｄ　ｎｃｅ　ａｆｔｒｅｉｎｖｉｔｒｏｆｅｒｉｔｌｉｚａｔｉｎｏ　０ｆ０ａ￣ｉｎｅ　ｏｏｃｙｔｅｓ　ｏｏｏｆｔｅ　ａｆｔｅｒｉｎ　ｖｉｔｒｏｍ砒　０ｎｉｎｔｈｅ　惜ｅＩｌｃｅ　０ｆｃｙｓｔｅａｎｆｉｎ［Ｊｊ．Ｂｉｄ　Ｒ　，　ｙｂｔｒｅａｔｅｄｗｉｈｔＡＡ一２Ｇｄｕｒｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏ　ｒｍｕｍｉｏｎ［Ｊｊ．Ｂｊｄ　０ｄ，２００１，５６：　１　８００—１　８０６．