G418筛选细胞
G418简介：
G418是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。 CAS No.：108321-42-2 分子式 ：C20H40N4O10?2H2SO4 分子量 ：692.71 [储运] 室温下运输, 干粉在室温下储存，溶液于-20℃储存。
G418工作原理：
它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
利用G418筛选细胞： 1、 准备工作
在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。每种细胞对G418 的敏感性不同，一般变动在100ug/ml~1000ug/ml范围。
《分子克隆》给出的几个常用细胞系所需G418 的最佳用量：
细胞系或机体 中国仓鼠卵巢细胞 G418浓度（ug/ml） 700~800 精品
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Madin-Darby犬肾细胞 人上皮A431细胞 猿CV-1细胞 盘基网柄菌属 植物 酵母 500 400 500 10~35 10 125~500
2、 确定最佳筛选浓度
最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。
①将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板。
②G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等12个级别, 培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右。筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。
★汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！
3、加药时间
①一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选（由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆）。
②每3~5d更换一次含有G418的筛选液（因为随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降），这时药物浓度可以降至200ug/ml。
4、培养液的使用
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡：
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①非选择性死亡：死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡。
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②阳性细胞的状态不佳甚至死亡：孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，导致阳性细胞死亡
这个时候需要一种特殊的培养液：转染前，在细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
5、挑选单克隆的优化（筛选阳性克隆）
目的：①尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响；
②增加阳性克隆的得率。
方法：加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。之后：
①套环法（结合有限稀释法）：用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
②刮除法（结合有限稀释法）：刮除阴性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
6、鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样
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再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。
细胞克隆----有限稀释法
有限稀释法采用梯变倍数稀释的原则，将稀释的细胞悬液接种于微孔培养板中（也可在板上的96孔中直接稀释）培养一定时间后，孔中可出现单个细胞克隆。本法不需特殊设备，操作简单快速，适合大大批量克隆化培养。现已广泛用于异质性细胞系的克隆化培养、诱导和分离，如耐药性细胞株或高转移性细胞株或突变细胞株以及单克隆抗体杂交瘤细胞株的克隆筛选中。
①取对数生长期的细胞制成悬液（贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成），经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上）。
②将细胞悬液在试管中稀释，用培养基将细胞稀释至50个/ml、10个/ml、5个/ml，将3种稀释度的细胞分别接种于96孔板中，每孔100 μl，于37℃、5% CO2下培养。
③次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加100 μl培养基继续培养。
④培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养基，1周左右，孔中有明显克隆出现。
⑤待克隆长直孔底面的1/3-1/2时，可用消化法将96孔板中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
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