中国农业科技导报，２０１５，１７（２）：４１－４８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 水稻ｙｌｌ黄叶突变体的基因克隆与功能分析 王丹霞， 权瑞党 ， 黄荣峰 （中国农业科学院生物技术研究所，北京１０００８１） 摘要：叶片是植物进行光合作用的重要器官，是作物产量形成的基础。作物叶色突变体不仅是研究叶绿体 发育机制、培育高光效新种质的前提，而且可以作为性状标记，应用于良种繁育及杂交育种。在经化学诱变 剂甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）处理的粳稻品种Ｋｉｔａａｋｅ突变体库中，筛选得到黄叶突变体ｙｌｌ，ｙｌｌ突变体的株高、穗 粒数、千粒重与野生型相比均降低。遗传分析表明， Ｊ黄叶表型由单隐型基因控制，图位克隆表明 Ｊ编码 叶绿素酸酯ａ氧化酶（ｅｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅ ａ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＯｓＣＡＯ１，ＬＯＣ—Ｏｓｌ０ｇ４１７８０）基因发生点突变；ｙｌＪ突变体 ＯｓＣＡＯ１突变位点位于催化功能域，没有改变其在叶绿体中的定位，且在不同物种之间高度保守，这表明该位 点可能是ＯｓＣＡＯ１的酶活关键氨基酸位点。 关键词：水稻；黄叶突变体；叶绿素酸酯ａ氧化酶；基因克隆；功能 ｄｏｉ：１０．１３３０４／ｊ．ｎｙｋｊｄｂ．２０１４．６８３ 中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０８６４（２０１５）０２—００４１－０８ Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｉｃｅ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌｅａｆ Ｍｕｔａｎｔ ｙｌｌ ＷＡＮＧ Ｄａｎ－ｘｉａ，ＱＵＡＮ Ｒｕｉ－ｄａｎｇ ，ＨＵＡＮＧ Ｒｏｎｇ—ｆｅｎｇ （Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｃａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： ａｆ，ａｌｌ ｃｒｕｃｉａｌ ｏｒｇａｎ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｒｏｐ ｙｉｅｌｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ａ ｔｒａｉｔ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｂｒｅｅｄｉｎｇｓ，ｌｅａｆ ｃｏｌｏｒ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｃｒｏｐｓ ａｒｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ．Ａ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｍｕｔａｎｔ（ｙｌＪ）ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｐｏｏｌ ｏｆ Ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ Ｋｉｔａａｋｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＥＭＳ）．Ｔｈｅ ｙｌＪ ｍｕｔａｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｌｏｗｅｒ ｐｌａｎｔ ｈｅｉｇｈｔ，ｌｅｓｓ ｇｒａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｌｅｓｓ １ ０００一ｒｇａｉｎ ｗｅｉｈｇｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｙｌ ｍｕｔａｎｔ ｗａｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｇｅｎｅ．Ｍａｐ—ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＯｓＣＡ０１（ＬＯＣ—Ｏｓｌ０ｇ４１７８０），ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅ ａ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ｈａｄ ａ Ｇ ｔｏ Ａ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ３９６ ｔｏ Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ｉｎ ｙｌＪ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＧＦＰ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ Ｇ３９６Ｒ ｏｆ ＣＡ０１ ｉｎ ｙｌｌ ｉｓ ｉｎ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ，ａｎｄ ｍａｄｅ ｎｏ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ＣＡＯ１ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，Ｇ３９６ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｔｈｅ ｋｅｙ ｐｏｉｎｔ ｆｏｒ ＯｓＣＡ０１ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓ Ｇ３９６ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｄｅｅ；ｙｅｌｌｏｗ—ｇｒｅｅｎ ｌｅａｆ ｍｕｔａｎｔ；ＣＡＯ１；ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ；ｆｕｎｃｔｉｏｎ 叶片是植物进行光合作用的重要器官，是作 光育种等应用于良种繁育及杂交育种 Ｊ。 物产量形成的基础。通过对叶色突变体的挖掘和 叶色变异主要分为黄花、白花、条纹、亮绿、浅 研究可以探究植物生理生化的分子机理¨’引。某 绿等，导致叶色变异的原因主要有两个方面：叶绿 些叶色变异可以影响植物内源激素的含量，因此 素合成受阻以及叶绿体发育受阻。叶绿素合成过 通过叶色突变体可以探究植物激素的合成途 程从谷氨酰－ｔＲＮＡ开始到叶绿素ｂ结束共由２０ 径 。另外，叶色变异可以作为性状标记 Ｊ，高 多个基因编码的１５种酶催化而成，在拟南芥中均 收稿日期：２０１４—１１—２５；接受日期：２０１４—１２—２４ ．基金项目：国家自然科学基金项目（３１１２０２５）资助。 作者简介：王丹霞，硕士研究生，研究方向为水稻叶色基因克隆与功能研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｄａｎｘｉａｗａｎｇｌ０１１＠１６３．ｃｏｎ。 通信作者：权瑞 党，副研究员，博士，主要从事植物分子生物学研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｑｕａｎｒｕｉｄａｎｇ＠ｃａａｓ．ｃａ ４２ 中国农业科技导报 １７卷 已被克隆。而水稻中也克隆出来了部分叶绿素合 成的基因，如：ＯｓＤＶＲ 、ＯｓＣＨＬＨ 、ＯｓＣＨＬＤ、 ＯｓＣＨＬＩ Ｊ、ＯｓＹＬ１［ ］ＯｓＣＡ０１［ 等编码的蛋白质均 为催化叶绿素合成过程中的酶，其中任何基因发 生突变都将影响叶绿素的合成，导致叶色变异。 叶绿体由前质体发育而来，由叶绿体外被、类囊体 和基质构成，光照条件下，叶绿体基因及核基因可 诱导前质体发育为叶绿体。当这些基因突变后， 影响叶绿体正常发育，导致叶色变异，水稻中已经 报道的与叶绿体发育相关的基因主要有： ＯｓＶＹＬｌ２］ＯｓＹＬＣ［１ｏ］、、ＯｓＣＨＲ４ｌ１ 等。此外，类胡萝 卜素、花青素、血红素及番茄红素的代谢途径相关 基因的突变都将导致叶色变异 。 虽然水稻中已经克隆了许多叶色相关的基 因，但是对于深入探究叶绿素合成途径的机理，叶 绿体的发育及相关蛋白质的转运机制还比较欠 缺，因此需要克隆出更多的叶色突变体基因。本 研究从ＥＭＳ诱变获得的水稻突变体库中筛选到 一份黄叶突变体 Ｊ，该突变体在整个生育期均表 现为叶片黄绿色、植株矮小。对该突变体进行农 艺性状统计，叶绿素含量的测定以及叶绿体结构 的电镜观察，并通过图位克隆及精细定位等方法 确定了突变基因，为进一步研究水稻叶绿素合成 的机理奠定了基础。 １材料与方法 １．１供试材料 Ｋｉｔａａｋｅ突变体库由本实验室创建，黄叶突变 体ｙｌｌ由本实验室筛选并保存。籼稻品种Ｄｕｌａｒ 用于Ｆ：分离群体构建，由本实验室保存。 １．２主要农艺性状统计及分析 水稻成熟期，分别随机取Ｋｉｔａａｋｅ野生型，ｙｌｌ 突变体植株各１０株测量株高及主穗粒数。种子 成熟后，分别称取Ｋｉｔａａｋｅ野生型和ｙｌｌ突变体 １ ０００粒种子称重，统计千粒重。 １．３光合色素含量及光合速率参数的测定 叶绿素含量参照Ｐｏｒｒａ方法 进行测定。选 取生长２０ ｄ左右的幼苗，分别准确称取３份 ０．１ ｇ，剪碎浸泡在８０％丙酮中研磨，定容至 １０ ｍＬ，用紫外分光光度计（ＳＰＥＫＯＬ １３００，德国） 测定６６３．６ ｎｍ、７５０ ｎｍ和６４６．６ ｎｍ波长的吸光 值，按照以下公式计算叶绿素含量。 Ｃｈｌａ（ＬＬｇ／ｍＥ）＝１２．２５ Ｅ 。＿＿＿一２．５５ Ｅ Ｃｈｌ ｂ（ ｇ／ｍＬ）＝２０．３１ Ｅ ～一４．９１ Ｅ Ｃｈｌ（ａ＋ｂ）（Ｉｘｇ／ｍＬ）＝１７．７６ Ｅ６４６．６＋７．３４ Ｅ鲫 由ＬＩ－６４００ＸＴ（ＬＩ—ＣＯＲ，Ｉｎｃ）便携式光合仪分 别测定Ｋｉｔａａｋｅ野生型及 Ｊ突变体一个月龄苗 叶片的净光合速率ｐｈｏｔｏ、气孔导度、胞间ＣＯ 浓 度和蒸腾速率，参数设定为气室ＣＯ 浓度 ４００￣ｍｏｌ／ｍｏｌ，光强８００ ｔｘｍｏｌ／ｍ ・ｓ，温度３０℃。 每个样品测定４个重复。 １．４叶绿体超微结构观察 分别选取Ｋｉｔａａｋｅ野生型 突变体半月龄 幼苗叶片，切成１ ｍｍ×２ ｍｍ小块，在０．２ ｍｏｌ／Ｌ 磷酸缓冲液配成的２．５％戊二醛溶液中４￣Ｃ固定 ４ ｈ，１％的０ｓＯ 在４￣Ｃ条件下漂洗并孵育过夜，梯 度乙醇溶液逐级脱水、包埋，最后用醋酸铀染色， 在ＪＥＯＬ ＪＥＭ一１２３０透射电子显微镜（日本）下观 察照相。 １．５ Ｆ：群体构建与基因定位 以ｙｌｌ突变体为母本、Ｄｕｌａｒ为父本杂交得到 Ｆ 群体，自交得到Ｆ 定位群体。选取Ｆ 群体中黄 叶表型单株２０４株进行图位克隆。用ＣＴＡＢ法提 取水稻基因组ＤＮＡ，采用群组分离分析法（ｂｕｌｋ ｓｅｇｒｅｇａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ）进行初定位。利用Ｉｎｄｅ１ 分子标记筛选亲本之间的多态性，随机选取Ｆ：群 体中突变型单株１０株，构建突变混池。通过突变 混合池分析可能与目的基因所在染色体连锁的分 子标记，确定突变基因所在染色体范围。根据网 站（ｈｔｔｐ：／／ｆｌｅｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）所公布的水 稻品种测序结果得到ＩｎＤｅ１分子标记，设计分子 标记引物，通过Ｆ：群体中黄叶表型的单株进行精 细定位。ＰＣＲ反应体系为１５ ＩｘＬ：２×Ｔａｑ Ｍｉｘ ７．５ Ｌ，模板ＤＮＡ １ Ｌ，正反引物（表１）３ Ｌ， ｄｄＨ２Ｏ ３．５／ｘＬ。ＰＣＲ产物以４％的琼脂糖凝胶电 泳分离，经凝胶扫描成像仪分析结果。由以下公 式计算交换率： 交换率＝（单交换＋双交换ｘ２）／（突变型单株 总数ｘ２）×１００％ 通过交换率确定目标基因所在的区域。根据 网站（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ＩＴＩ￥Ｕ．ｅｄｕ／）和（ｈｔｔｐ：／／ ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｉｒｅ．ｇｏ．ｊｐ／）上水稻基因的注释选取候选 基因，设计引物测序（表２），确定候选突变基因。 ２期 王丹霞等：水稻ｙｆ 黄叶突变体的基因克隆与功能分析 ４３ Ｍ２６２２ ５ 一ＣＧＣＧＧＧＡＴＣＡＴＡＣＡＡＡＧＧＣＴＡＧＧ一３ ５ 一ＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧ．３ ５ 一ＧＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＴＧＴＣＡＴＣ ＩＴＣＧ一３ ５ 一ＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴｒＧＴＩ’Ｉ’Ｇ一３ ５ 一ＡＣＣＧＡＡＣＧＧＧＴＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣ一３ Ｍ２８４０ Ｍ２６４２ Ｍ２６５４ ５ 一ＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＡＣＡＣＴＣＧＣＡＴＣＧ一３ ５ ．ＴＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＴＡＧＴＣＧ一３ ５ 一ＣＣＣＣＣＡＡＴＡＴＣＴｒＧＡＣＧＴＧＴ．３ Ｍ２６７２ ５ ．ＴＧ ＩＴｒＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＡ。３ ５ 一ＡＡＧＡＣＴｒＧＧＡＴＣＴｒＧＣＧＧＴＧ一３ Ｏｓｌ０ｇ４１７６０－１ ＯｓｌＧ ｇ４１７６０—２ Ｏｓｌ０ｇ４１７６０－３ ＯｓｌＯｌｇ４１７６０－４ ５ ．ＴＧＴＧＡ ＩｆｒＣＧＡ ｒｒＣＡｒＩＴＣＴ．３ ５ 一ＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＴ一３ ５ 一ＣＴＡＴｒＧＧＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣ．３ ５ ．ＡＣＡＡＣ ＩＴＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＴＡ．３ ５ ．ＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＡＴＡＴＩ１Ｃ．３ ５ 一ＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＣＣＡＴＡＣ一３ ５ ．ＡＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＡＧＴＡＡＴＧＣＡ．３ ５ 一ＡＣＣＣＡＧＧＴＩＴＧＧＣＣＣＧＴＧＡＣＴＡ一３ ５ ．Ｇ ＩＴＡＡＣＣＴＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＣＣＧ．３ ５ ．ＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＧ ＩＩＡＴＧＡＧＴ一３ ５ ．ＧＴＡＴＧＡＴＣＡＴＡ ＩＩＡＴＡＴＧＣＡＴＣ一３ ５ 一ＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡ ＩＴＡＣＡＧＴＩ’Ｉ＇Ｇ一３ ＯｓｌＯｇ４１７８０—１ Ｏｓｌ００ｇ４１７８０—２ Ｏｓｌ０ｇ４１７８０・３ ＯｓｌＧｌｇ４１７８０—４ ５ 一ＣＡＧＡＡＡＡ ＩＴＣＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣ一３ ５ 一ＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＴＣＣ一３ ５ 一ＡＴＣＡＴＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡ－３ ５ 一ＧＴＣＣＡＴＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴｒＡＣＡＧＴＩＴｒＧ．３ １．６突变基因生物信息学分析 １－８ ＣＡＯ１亚细胞定位 通过生物信息学网站ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）获得ＯｓＣＡＯ１及同源基因的氨 基酸序列，用ＤＮＡＭＡＮ软件分析其氨基酸序列的 相似性，用ＭＥＧＡ５．０５软件进行系统进化树的 分析。 １．７ Ｒｅａ１．Ｔｉｍｅ ＰＣＲ 采用常规分子克隆方法分别构建ＣＡ０１及 ＣＡＯｌｍ编码区与ＧＦＰ编码区（载体为ｐＣＭ１２０５） 的融合载体，所用引物为：ＣＡＯ１ＧＦＰ—Ｆ（５ 一ＡＣＴＡ－ ＧＴＡＴＧＡＣＣＡＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＧＣＴＧ－３ ），ＣＡＯ１ＧＦＰ－ Ｒ（５ ．ＴｃＴＡｃＡＴＧＡＴｃｃＡｃＴｃＴｃＡｃＴ＿ＩＴＧ．３ ）。 参 照Ｙｏｏ等 刮方法提取水稻原生质体，通过ＰＥＧ 介导法将纯化后ＣＡＯ１一ＧＦＰ和ＣＡＯ１ｍ—ＧＦＰ质粒 分别取Ｋｉｔａａｋｅ野生型抽穗期的根、茎、叶、叶 鞘和穗不同组织的材料，由ＴＲＩｚｏｌ试剂盒（天根 生化有限公司）提取ＲＮＡ，并反转录为ｃＤＮＡ，通 过ｉＱ５ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ 荧光定量ＰＣＲ分析ＯｓＣＡＯ１及ＯｓＣＡ０２的组织表 转化水稻原生质体，２８￣Ｃ黑暗培养１６ ｈ，通过 ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ ７００激光共聚焦显微镜观察ＧＦＰ荧光 的亚细胞定位并照相。 ２结果与分析 ２．１体表型及主要农艺性状 达特异性，反应程序：９５℃，１０ ｍｉｎ；９５￣Ｃ，１５ Ｓ； ５８℃，３０ Ｓ；７２℃，２０ Ｓ，４５个循环。所用的引物为 ＯｓＣＡＯ１（５’－ｒＩ１０ＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＧＴＣＡＧＴＣｌＧＡｒＩ＇Ｇ－３’）， ＯｓＣＡＯ Ｉ Ｒ ｆ ５’－ＣＣＴＴＣＣＡＴＩ１ＡＧＣＣｒＩＴＩＴＣＣＴＣＴＣＣ一 以甲基磺酸乙酯处理粳稻品种Ｋｉｔａａｋｅ种子， ３’），ＯｓＣＡＯ２Ｆ（５’一ＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣ－ ＣＣＴＩＴＣ－３’），ＯｓＣＡＯ２Ｒ（５’－ＣＡＴＩＴＡＴＣＡＴＣＣＧＣ— ＴＣＴＹＧＣＴＧＣＣ一３’）。 获得Ｍ 突变体库，将此Ｍ 突变体库繁种一代，得 到Ｍ 突变体库，在Ｍ 突变体库中筛选叶色变异 突变体，获得一份黄叶突变体 ，整个生育期表 现为黄叶。 ４８ 中国农业科技导报 １７卷 步研究需要采用生化方法分析该点突变是否影响 ＯｓＣＡ０１的催化活性，从而更好的解释ＯｓＣＡＯ１ 叶绿素合成中的分子基础。本研究中所获得的 ＯｓＣＡ０１点突变水稻突变体为进一步研究 ＯｓＣＡＯＩ的功能提供了特异的材料。 参考文献 ［１］Ｗｕ ｚ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｈｅ Ｂ，ｅｔ ａ１．．Ａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ—ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｒｉｃｅ ｍｕｔａｎｔ ｗｉｔｈ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．，２００７，１４５（１）：２９—４４． ［２］Ｄｏｎｇ Ｈ，Ｆｅｉ Ｇ Ｌ，Ｗｕ Ｃ Ｙ，ｅｔ ａ１．．Ａ ｒｉｃｅ ｖｉｒｅｓｃｅｎｔ—ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｍｕｔａｎｔ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄ ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．， ２０１３，１６２（４）：１８６７—１８８０． 【３］ Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｓ Ｈ，Ｑｉｎ Ｘ，Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ Ａ．Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｍｕｔａｎｔｓ，ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．，２００３，１３１（４）：１５９１—６０１． ［４］Ｗｕ Ｄ，Ｓｈｕ Ｑ，Ｘｉａ Ｙ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒｍｏ／ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｅｎｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｗｉｔｈ ｇｒｅｅｎ—ｒｅｖｅｒｔｉｂｌｅ ｘａｎｔｈａｎ ｌｅａｆ ｃｏｌｏｒ ｍａｒｋｅｒ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ， ２００２，１２３（２）：１９５—２０２． ［５］Ｏｈ Ｓ Ａ，Ｐａｒｋ Ｊ Ｈ，Ｌｅｅ Ｇ Ｉ，ｅｔ ａ１．．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃｉ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１９９７，１２（３）：５２７—５３５． ［６］Ｗａｎｇ Ｐ，Ｇａｏ Ｊ，Ｗａｎ Ｃ，ｅｔ ａ１．．Ｄｉｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｏｒｐｈｙｌｌ（ｉｄｅ）ａ ｃａｎ ｂｅ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｔｏ ｍｏｎｏｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ（ｉｄｅ）ａ ｂｙ ａ ｄｉｖｉｎｙｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎ ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．，２０１０，１５３（３）：９９４ —１００３． ［７］Ｊｕｎｇ Ｋ Ｈ，Ｈｕｒ Ｊ，Ｒｙｕ Ｃ Ｈ，ｅｔ ａ１．．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ－ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ・ ＤＮＡ ｇｅｎｅ－－ｔｒａｐ ｓｙｓｔｅｍ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏ１．，２００３，４４（５）：４６３—４７２． ［８］ＺｈａｎｇＨ，Ｌｉ Ｊ，Ｙｏｏ Ｊ Ｈ，ｅｔ ａ１．．Ｒｉｃｅ ｃｈｌｏｒｏｒｉｎａ一１ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｉｎｅ一９ ｅｎｃｏｄｅ ｅｈｌＤ ａｎｄ Ｃｈｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ Ｍｇ－ｅｈｅｌａｔａｓｅ，ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，２００６，６２（３）：３２５—３３７． ［９］Ｌｅｅ Ｓ，Ｋｉｍ Ｊ Ｈ，Ｙｏｏ Ｅ Ｓ，ｅｔ ａ１．．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏ１．， ２００５，５７（６）：８０５－８１８． ［１０］Ｚｈｏｕ Ｋ，Ｒｅｎ Ｙ，Ｌｖ Ｊ，ｅｔ ａｌ—Ｙｏｕｎｇ ＩＪｅａｆ Ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ １，ａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ—ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａｎｄ ｌｕｔｅｉｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｌｅａｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｒｉｃｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔａ，２０１３，２３７（１）：２７９－２９２． ［１１］ Ｚｈａｏ Ｃ，Ｘｕ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｙ，ｅｔ ａ１．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＯｓＣＨＲ４，ａ ｒｉｃｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ—ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ａｄａｘｉｌａ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２０１２，２３６（４）：１１６５—１１７６． ［１２］ Ｆａｎｇ Ｊ，Ｃｈａｉ Ｃ，Ｑｉａｎ Ｑ，ｅｔ ａ１．．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｐｒｅｃｕｍｏｍ ｏｆ ＡＢＡ ｌｅａｄ ｔｏ ｐｒｅ— ｈａｒｖｅｓｔ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏ—ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２００８，５４（２）：１７７—１８９． ［１３］ 王军，王宝和，周丽慧，等．一个水稻新黄绿叶突变体基 因的分子定位［Ｊ］．中国水稻科学，２００６，２０（５）：４５５－４５９． Ｗａｎｇ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｂ Ｈ，Ｚｈｏｕ Ｌ Ｈ，ｅｔ ａ１．．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｙｅｌｌｏｗ—ｇｒｅｅｎ ｌｅａｆ ｇｅｎｅ ｙｇｌ一２ ｉｎ ｒｉｃｅ ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｒｉｃｅ Ｓｃｉ．，２００６，２０（５）：４５５－４５９． ［１４］ Ｃｈａｉ Ｃ，Ｆａｎｇ Ｊ，Ｔｏｎｇ Ｈ，ｅｔ ａ１．．ＺＥＢＲＡ２，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｅｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，２０１１，７５（３）：２１１—２２１． ［１５］ Ｐｏｒｒａ Ｒ Ｊ．Ｔｈｅ ｃｈｅｑｕｅｒｅｄ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｓ ａ ａｎｄ ｂ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ．Ｒｅｓ．，２００２，７３（卜３）： １４９－１５６． ［１６］ Ｙｏｏ Ｓ Ｄ，Ｃｈｏ Ｙ Ｈ，Ｓｈｅｅｎ Ｊ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓ￣ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２００７，２（７）：１５６５—１５７２． ［１７］ Ｈｉｒａｓｈｉｍａ Ｍ，Ｓａｔｏｈ Ｓ，Ｔａｎａｋａ Ｒ，ｅｔ ａｌ—Ｐｉｇｍｅｎｔ ｓｈｕｆｌｆｉｎｇ ｉｎ ａｎｔｅｎｎａ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅ ａ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．， ２００６，２８１（２２）：１５３８５—１５３９３． ［１８］ Ｔａｎａｋａ Ｒ，Ｋｏｓｈｉｎｏ Ｙ，Ｓａｗａ Ｓ，ｅｔ以．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅ ａ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＣＡＯ）ｅｎｌａｒｇｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｅｎｎａ ｓｉｚｅ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２００１，２６ （４）：３６５—３７３． ［１９］ Ｔａｎａｋａ Ａ，ｈｏ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｒ，ｅｔ ａ１．．Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ （ＣＡＯ）ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｂ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａ［Ｊ］．Ｐｒｅｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５（２１）：１２７１９ —１２７２３． ［２０］ Ｏｓｔｅｒ Ｕ，Ｔａｎａｋａ Ｒ，Ｔａｎａｋａ Ａ，ｅｔ ａ１．．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｂ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＣＡＯ）ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２０００，２１（３）：２０５—２１０． ［２１］ Ｙａｍａｓａｔｏ Ａ，Ｎａｇａｔａ Ｎ，Ｔａｎａｋａ Ｒ，ｅｔ ａ１．．Ｔｈｅ Ｎ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅ ａ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ Ｂ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００５，１７（５）：１５８５—１５９７．