不同生理状态下草丛土毛虫的细胞结构及大核DNA多态性研究

不同生理状态下草丛土毛虫的细胞结构及大核DNA多态性研究 【摘要】：原生动物是动物界中最简单、最低等的单细胞真核生物。土壤原生动物作为原生动物中的一个类群,在土壤生态系统中起着至关重要的作用,土壤原生动物与水生原生动物之间既相互联系又区别明显。土壤纤毛虫具有特有的生活状态以及与土壤生活相适应的形态结构跟生理机能,尤其是土壤纤毛虫所拥有的随着土壤颗粒及干湿度的变化发生形成包囊和脱包囊的生活史,是细胞对特殊环境条件的一种适应性特征。到目前为止,诸多学者已经对水生纤毛虫形态结构及其包囊做了比较多的研究,但是对于土壤纤毛虫的研究还甚少,仅限于生态功能、群落特征和物种分布等几个方面。作者对土壤纤毛虫的细胞形态、皮层结构模式、细胞质的细胞器以及核器等超微结构的研究是想进一步了解土壤纤毛虫是如何适应土壤生境的,以及土壤纤毛虫与淡水纤毛虫之间的亲缘关系,还想更深入的了解土壤纤毛虫包囊的发生及包囊的形态、细胞结构特征等,此研究对于进一步揭示土壤纤毛虫细胞结构的分化、细胞模式的形成、种群的分类以及探索其在系统发生过程中的演化地位等都有极为重要的生物学意义。本文对国内外有关土壤纤毛虫的研究做了充分调研,以作者所在实验室在浙江温州所采集到的一种大型的腹毛类土壤纤毛虫——草丛土毛虫(Territrichastramenticola)为研究材料,分别用正常生理状态的营养期细胞与经过人工诱导后产生的休眠阶段的包囊,对其进行FLUTAX荧光标记、抗Q-微管蛋白免疫荧光标记,以及扫描电镜术和透射电镜术等

多种技术手段的应用,系统的比较观察了其营养细胞与休眠包囊的形态、皮层细胞质及其各种胞器的结构；应用RAPD方法,分别对草丛土毛虫的营养细胞与休眠细胞的大核DNA进行了探索。结果如下：应用FLUTAX直接荧光和抗Q-微管蛋白抗体免疫荧光标记显示,草丛土毛虫细胞皮层含有口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛、背触毛等纤毛器及其纤毛器骨架、纤毛器基部附属微管和其他皮层非纤毛器微管骨架等组成的微管胞器。其中：口围带和波动膜基部形成小膜托架、小膜附属微管及波动膜骨架；波动膜由数量众多的的细小微管相互交织组成的密集微管网构成；额腹横棘毛基部和左右缘棘毛基部由前纵微管束、后纵微管束和横微管束三部分微管组成；背触毛基部含前纵微管束和后纵微管束。所得结果中,其横棘毛基部具有较发达的横微管束,这在其他纤毛虫中未见报道；并且,细胞皮层纤毛器在其表膜下形成的纤毛器基部微管骨架,较尖毛科的水生纤毛虫同种结构发达。据此推测,土毛虫细胞皮层微管胞器的形态特征可能与细胞在土壤中的生命活动相适应,其发达的纤毛器基部微管为其表面纤毛器的运动提供了有力的支撑,有利于纤毛虫在土壤团粒间的运动和取食,这也是细胞与环境间长期相互作用的结果。扫描电镜观察显示,草丛土毛虫的营养细胞中,腹皮层口围带含小膜55-70片,波动膜2片,额腹横棘毛和左右缘棘毛在细胞腹面按8-9-7模式分布,背触毛8列。该纤毛虫的腹皮层纤毛器较发达,除口围带和波动膜外,其纤毛器的发达程度按额棘毛、横棘毛、腹棘毛、缘棘毛逐渐递减。此外,在细胞的额区前表面呈棘突样,在其他纤毛器附近的皮层表面呈波纹样。据所

得结果推测,该纤毛虫发达的皮层纤毛器及特殊的皮层表面,可能是细胞在土壤颗粒间隙水中运动及其与环境相互作用的结果。纤毛虫的休眠包囊为球形或者扁球形,直径70-80μm；包囊壁的背面由无数六边形的鳞片紧密排列而成,呈蛇皮状；包囊壁的腹面内凹,中央有包囊孔。据纤毛虫包囊壁背面的形态分析,该包囊壁可能是土壤纤毛虫形成包囊后细胞抵御干燥环境、延长水分散失的特殊结构；据纤毛虫包囊形成过程中细胞紧贴下部基质及分泌物质形成包囊壁的现象认为,包囊孔与周围的壁结构一起,可能具有使包囊细胞固定在土壤基质表面的作用。结果表明,土毛虫的休眠包囊是细胞在土壤环境中形成的一中特殊型包囊。透射电镜结果显示,在草丛土毛虫的营养细胞中,除纤毛器结构外,皮层由表膜和表膜下表质层构成,表质层由一层微管对其加固；由微管聚集而成的微管束或者微管带集中存在于皮层纤毛器和腹面棘毛区的皮层表膜下；细胞质内含有极其丰富的线粒体、食物泡等胞器结构；核孔呈虚线状分布于大核中,阿米巴样的囊泡结构附着在核膜外,核仁和染色质聚集成大、小不等的团块分散分布其中,部分染色质与核内膜紧密相连。所得结果充分表明,纤毛虫的营养期细胞具有对土壤环境的适应性细胞结构,此结构更加有利于其运动与取食；纤毛虫的细胞质胞器及核器是细胞进行新陈代谢生命活动的明显特征。形成包囊后的纤毛虫,其细胞皮层纤毛器及与其相联系的微管类骨架彻底消失。通过观察发现,草丛土毛虫的包囊壁结构较特殊,由两层结构组成,其中大小相近的长方形小室相互聚集排列形成外层壁,而较厚的、透明的、紧贴在表膜上的内层壁与外层壁紧密相连,成为表

膜向包囊壁过渡的结构物质：休眠细胞内含有大量的线粒体以及吞噬许多细胞器的自噬泡,其具有不同消化阶段的结构特点；大核核膜与核外细胞质之间分界明显,其核内染色质呈均一状分布,巨大型中央核仁位于大核中央,呈低电子密度状态。据此推测,纤毛虫形成包囊过程中皮层纤毛结构及微管结构全部瓦解或被细胞吸收,因此该纤毛虫所形成的“毛基体吸收型包囊”具有典型的尖毛科纤毛虫模式；相较之水生纤毛虫休眠包囊的壁结构,草丛土毛虫休眠包囊所具有特殊的包囊壁结构,为细胞形成包囊后便于在干燥环境中储备较多的水分、维持其特殊生理状态下的生命活动提供了必要的条件；同时,在休眠细胞内清晰可见自噬泡类细胞器,而其他细胞器数目锐减,并且与调节细胞代谢活动相关的营养期大核的结构形态在休眠细胞中也变化显著,说明存在于不同营养细胞的生命活动过程中的自噬泡结构可能是食物泡的另一种特殊的结构状态,它的作用可能为休眠细胞提供基本的营养和能量来源。作者用RAPD方法分别对草丛土毛虫的营养细胞和休眠细胞的大核DNA进行了比较研究,实验共选用随机引物32条,其中30条引物能够扩增出134条片段,用营养细胞大核DNA为模板可以扩增出54条片段,而以休眠细胞大核DNA为模板则扩增出80条片段,营养细胞于休眠细胞大核DNA之间共有20条共享片段,其共享度为30%。由此得出,同种纤毛虫的营养细胞大核DNA和休眠细胞大核DNA的差异明显。据此推断,在形成包囊时,大核DNA的结构可能发生了剧烈的变化,而这些变化与细胞在包囊形成过程中结构和代谢的变化以及生理活动的改变息息相关。与营养细胞相比较,其形态学的

观察结果充分显示,在形成包囊时,土壤纤毛虫的细胞结构可能经历了更深入的脱分化过程。作者用两种淡水纤毛虫(游仆虫和急纤虫)的RAPD数据与草丛土毛虫的实验结果相比较后发现,草丛土毛虫的营养细胞与休眠细胞的共享度与形成“毛基体吸收型包囊”的水生纤毛虫相比,要明显低的多,推测这可能与该土壤纤毛虫形成包囊时细胞对纤毛器和其他微管类胞器的的吸收更为彻底、细胞分泌物质形成特殊的包囊壁等有关,也有可能是细胞形成包囊时的调控机制与淡水纤毛虫不尽相同；此外,其营养细胞与休眠细胞的共享片段的强弱也有所差异,以上数据说明即使是共有的DNA片段,在营养状态与休眠状态下的含量也是不完全一致的。【关键词】：土壤纤毛虫草丛土毛虫营养细胞休眠包囊微管胞器超微结构大核DNA 【学位授予单位】：华东师范大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2010 【分类号】：S154.5

【目录】：摘要6-10Abstract10-17第一章草丛土毛虫皮层微管胞器的荧光标记17-341材料和方法18-211.1实验材料18-191.2实验仪器设备191.3实验主要试剂19-201.4方法20-212结果21-232.1FLUTAX直接荧光标记21-222.2抗A-微管蛋白的免疫荧光标记22-233讨论

23-253.1草丛土毛虫细胞皮层纤毛器及其附属微管23-243.2草丛土毛虫无性分裂期纤毛器微管胞器的形态变化24-25参考文献25-34第二章草丛土毛虫营养细胞和休眠包囊的扫描电镜观察34-581材料和方法36-381.1实验材料361.2实验仪器设备361.3实验试剂36-371.4扫描电镜样品制备方法37-382结果38-402.1营养期形态38-392.2包囊的形成及休眠包囊的形态39-403讨论40-423.1草丛土毛虫种的初步鉴定40-413.2草丛土毛虫与土壤生活相适应的特征413.3草丛土毛虫包囊的形成41-42参考文献42-58第三章草丛土毛虫营养细胞和休眠包囊的透射电镜观察58-971材料和方法60-621.1实验材料601.2实验仪器设备601.3实验试剂60-611.4透射电镜样品制备方法61-622结果62-662.1草丛土毛虫营养期的超微结构62-642.1.1纤毛虫皮层超微结构62-632.1.2纤毛虫细胞质超微结构63-642.2草丛土毛虫休眠包囊的超微结构64-662.2.1包囊壁及细胞表膜64-652.2.2表膜下胞器及核器65-663讨论66-713.1草丛土毛虫对土壤环境适应的结构特征66-673.2草丛土毛虫休眠包囊的分化特征67-713.2.1包囊壁的分化67-683.2.2草丛土毛虫休眠包囊的类型68-703.2.3大核形态的变化703.2.4包囊现象的系统学意义70-71参考文献71-97第四章不同生理状态下草丛土毛虫大核DNA多态性比较97-1091材料和方法98-1021.1实验材料981.2实验仪器设备98-991.3实验试剂991.4大核DNA的制备99-1001.5DNA浓度及纯度的测定1001.6引物100-1011.7RAPD多态性条带的扩增及产物的分离1011.8电泳及分析101-1022结果102-1053讨论105-1073.1草丛土毛虫营养细胞与休眠

包囊DNA条带的差异1063.2草丛土毛虫营养细胞与休眠包囊DNA含量的差异106-107参考文献107-109第五章土壤原生动物及纤毛虫包囊现象的研究(综述)109-1331土壤原生动物及纤毛虫包囊现象研究的相关技术简介110-1141.1银浸法1101.2蛋白银染色方法1101.3扫描电镜术和透射电镜术110-1111.4荧光标记法111-1121.5免疫胶体金技术112-1131.6电镜酶细胞化学方法和电泳酶化学反应方法1131.7基因沉默技术113-1142土壤原生动物的研究114-1202.1土壤原生动物概述114-1152.2土壤原生动物的起源115-1162.3土壤原生动物的分布及其特征116-1192.4我国土壤原生动物的研究119-1203纤毛虫的包囊现象的研究120-1263.1包囊的类型和形态结构121-1243.2包囊形成和脱包囊过程中的生命活动124-1253.3包囊现象的研究意义125-1264结语126-127参考文献127-133附录:缩略语133-135致谢135-136 本论文购买请联系页眉网站。