HPLC法测定苦荞茶中芦丁＼槲皮素的含量

HPLC法测定苦荞茶中芦丁＼槲皮素的含量

[摘要] 建立了高效液相色谱法测定常见苦荞茶中芦丁槲皮素成分含量的方法。色谱柱：SHIMDZU VP-ODS，流动相：甲醇-0.08%磷酸溶液（6∶4），流速：0.9 5mL·min-1，检测波长：360 nm，进样量：5 µL。芦丁在0.048-0.32 µg范围内与峰面积成良好线性关系，r=0.9997，槲皮素在0.028-0.19 µg范围内与峰面积成良好线性关系，r=0.9996，加标回收率为98.7%，RSD为0.013%。本方法操作简便快捷，重复性好，结果准确可靠。

[关键词] HPLC法 苦荞茶 芦丁 槲皮素 含量测定

苦荞是我国独有的药食两用粮食作物，主要分布于我国内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、四川、云南等高寒地区[1]，近年来苦荞茶作为人们最热衷的保健饮品之一，在降低血压胆固醇，防治心脑血管疾病及高脂血症方面疗效显著[2]。苦荞茶中富含黄酮类物质，其主要成分为芦丁、槲皮素等[3,4]，能够降低毛细血管脆性，改善微循环功能，具有抑制肿瘤、防止衰老、降低血脂、增强免疫力、镇静止痛、保护心脏和肝脏等作用[5]，在临床上主要用于糖尿病、高血压的辅助治疗[6,7]。本实验通过优化提取工艺，进行了方法学考察，建立了苦荞茶的HPLC含量测定方法，并对不同苦荞茶中两种黄酮类组分进行了比较，为更好地控制苦荞茶的质量提供了一种简便、可行、重复性好的质量控制方法。

1、仪器与试药

LC210AT型高效液相色谱仪（岛津公司），二极管阵列检测器，CLASS2vp510色谱数据处理工作站，CDT26A色谱柱温箱；SZ293型自动双重纯水蒸馏器。芦丁、槲皮素对照品，由中国药品生物制品检定所提供。4种苦荞茶样品购于绵阳专卖店，（生产企业及批

号见表2），甲醇为色谱纯，磷酸等其他试剂为分析纯，水为高纯水。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SHIMDZU VP反相色谱柱；流动相：甲醇-0.08%磷酸溶液（6∶4）；检测波长：360 nm；流速：0.95 mL·min-1；柱温：35℃。进样量：5 µL。在选定条件下，芦丁、槲皮素色谱峰与其他杂质峰达到基线分离，分离度（R）大于1.5，以芦丁、槲皮素计理论塔板数均不低于3500。

2.2 对照品溶液制备

精密称量芦丁对照品8.0 mg、槲皮素对照品4.7 mg，分别置25 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，分别精密吸取1 mL稀释10倍，制成每1 mL中含有32 µg芦丁18.8 µg槲皮素的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取苦荞茶样品适量，研细，精密称定约0.5 g，置于25 mL锥形瓶中，加入甲醇15 mL，避光超声处理40 min，上清液转入25 mL容量瓶。分别用5 mL甲醇重复提取2次，合并提取液，甲醇定容至25 mL，摇匀，微孔针头过滤器过滤，待测。

2.4 线性关系考察

精确吸取浓度为32µg·ml-1芦丁、18.8µg·ml-1槲皮素混合对照品溶

液1.5，3.0，4.5，6.0，7.5，9.0，10.0 µL，注入液相色谱仪，测定其峰面积积分值，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程：芦丁为A=5.1156×104-0.47171×104，r=0.9997，进样量0.048-0.32 µg范围内线性关系关系良好；槲皮素为A=5.3506×104+1.8585×104，r=0.9996 ，进样量0.028-0.19 µg范围内线性关系关系良好。

2.5精密度试验

精密吸取同一份对照品溶液各5 µL，在2.1色谱条件下重复进样5次，记录其峰面积积分值，芦丁RSD=0.7 %，槲皮素RSD=1.7 %，结果表明仪器精密性良好。

2.6 稳定性试验

分别精密吸取同一供试品溶液，于0，2，4，6，8 h进样各5 µL，测定，记录峰面积积分值，峰面积积分值的RSD=1.4 %，结果表明：供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.7 重现性试验

取同一份样品5份(产品标准号68792824)，按2.1色谱条件测定槲皮素含量，结果平均含量为966 µg·g-1，RSD=1.4 %，方法具有良好的重现性。

2.8 回收率试验

分别精密称取5份已知芦丁含量为0.35% 的样品（批号：100206）0.5g，各加入芦丁对照品溶液（0.32 mg·mL-1）5.5 mL，按2.3供试品溶液制备方法制备待测溶液，每样重复测定3次。结果见表1。

表1 回收率测定结果

样品含量（mg） （%） RSD(%)

加入量（mg） 实测量（mg） 回收率（%） 平均回收率

1.7248 1.76 3.4360 98.6

98.7

0.013

1.7489 1.76 3.4633 98.7

1.7511 1.76 3.4760 99.0

1.7504 1.76 3.4633 98.1

1.7143 1.76 3.4430 99.1

2.9 样品测定

按文中拟定的芦丁、槲皮素含量测定方法，分别测定了4种苦荞茶中的芦丁、槲皮素的含量，色谱图见图1，结果见表2。

图1对照品与样品HPLC色谱图

A. 对照品B. 样品 1 芦丁2 槲皮素

表2 苦荞茶中芦丁、槲皮素的含量(n=5)

名称 生产单位 产品标准号 芦丁测定含量

% 槲皮素测定含量

%

三匠苦荞茶 西昌三匠苦荞开发有限公司 Q/68792824 0.024 0.85

三匠黑苦荞茶 西昌三匠苦荞开发有限公司 Q/68792824 0.030 0.96

环太黑苦荞茶 四川环太实业有限责任公司 Q/21301131 0.026 0.75

苦荞籽粒茶 四川强劲奥林食品饮料有限公司 Q/66966025 0.34 0.06

3、讨论与结论

3.1 检测波长的选择

芦丁、槲皮素对照品与供试品以本实验溶剂体系下，用二极管阵列检测器分析了对照品和样品中峰的紫外光谱，紫外扫描图谱表明，芦丁、槲皮素组分光谱图一致，其中芦丁最大吸收波长分别为203 nm、257 nm和358 nm，芦丁最大吸收波长分别为203 nm、254 nm和367 nm，203 nm处供试品中其它不明物组分有一定吸收，将对测定产生干扰，

导致测定误差，254 nm、367 nm虽无其它组分干扰吸收，但358 nm的吸收更强。同时也兼顾各组分的检测灵敏度，确定最佳检测波长为258 nm。

3.2 流动相的选择

本实验对文献[4,7]采用的流动相体系进行了比较试验，结果甲醇-0.08%磷酸（6∶4）相对于其他流动相有良好的分离效果，且峰形好，满足分析方法要求。

3.3溶剂的选择

试验中对芦丁槲皮素提取溶剂进行了比较，氯仿做为提取溶剂时芦丁槲皮素与不明组分峰无法有效分离，乙醇提取效率较低，较高的残存导致测定结果误差增大，甲醇为芦丁、槲皮素提取溶剂效果良好，芦丁、槲皮素与其他组分色谱峰能有效分离。

3.4 结论

不同厂家生产的4类产品测得的芦丁、槲皮素含量差别较大，因不同生产工艺对天然苦荞的加工方式不相同，产品中有部分芦丁已经发生水解，故部分样品测得槲皮素的含量较高，其中西昌三匠苦荞开发有限公司出品的黑苦荞茶槲皮素含量最高（0.96%），四川强劲奥林食品饮料有限公司出品的苦荞籽粒茶芦丁含量最高（0.34%），本方法为加工苦荞茶提供一定的参考。

参考文献：

[1] 曹树明，李菊，胡炜彦等.HPLC法测定苦荞茶中芦丁的含量[J].中国民族民间医药杂志，2007，86:173-175.

[2] 郑文霞.苦荞茶降糖、降脂作用的临床观察[J].山西中医学院学报，2003.4.30-31.

[3] 牛秀明.苦荞生物类黄酮药理作用研究进展[J].山东医学高等专科学校学报，2008.30.470-472.

[4] 彭镰心，赵钢，王姝等.不同品种苦荞黄酮含量的测定[J].成都大学学报.2010.3.20-21.

[5] 周元成.关于荞麦生物类黄酮的研究进展[J].山西农业大学学报, 2006, 26( 6) : 131- 133.

[6] 张平，王玉珠.荞麦中生物类黄酮的提取方法研究[J].食品研究与开发，2007，28( 2) : 45-47.

[7] 李裕，刘有智，霍红.苦荞麦中提取芦丁的工艺研究[J].华北工学院学报.2002.23.130-132.

[8] 李欣，王步军. 两种苦荞黄酮提取方法的优化及含量测定[J].食品科学.2010.31.80-85.

通讯作者：

*边清泉,男，山东泰安人，教授，研究方向：天然产物分离提取与检测。