程红新1 杨晓萍1 蒋雅红3 林智峰1赵瑾2 陶林2
新疆石河子大学医学院，1第一附属医院肾病科，2病理科，3第三附属医院医务部，新疆维吾尔自治区石河子市 832008
摘要：
背景：纤维连结蛋白(Fibronectin，Fn)表达增加在肾间质纤维化疾病进展过程中发挥着的重要作用。
目的：探讨纤维连结蛋白在肾间质纤维化（ RIF）大鼠肾组织中的表达及作用。 方法：72只SD大鼠随机摸球法均分为正常组、对照组和模型组。造模组建立单侧输尿管梗阻模型；对照组仅进行假手术；正常组不做任何处理。分别于造模后第1，3，7，14天分批处死大鼠，检测大鼠梗阻侧肾小管间质纤维化损伤程度并检测肾脏组织中纤维连接蛋白（FN）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达。 结果与结论：与正常组及对照组比较，梗阻时间越长，肾小管间质损害程度越重，纤维化越明显。造模后1 d大鼠肾脏组织FN、MMP-9表达水平即出现上调，造模后3d，TGF-β1表达水平出现上调，并均于第14天达最高水平，与同期正常组、对照组相比，差异有显著性意义（P <0.05）。说明在大鼠UUO肾纤维化形成过程中，FN的蛋白表达在肾损伤早期即显著增加，并随肾间质纤维化程度加重而逐步升高，从而促进肾纤维化的发生。而MMP-9的高表达可能是加重肾间质损害的因素之一。
关键词：单侧输尿管梗阻模型；纤维连接蛋白；基质金属蛋白酶-9；转化生长因子-β1；肾间质纤维化
The expression and its siginificance of Fibronectin in Rats at kidney with Renal Interstitial Fibrosis
CHENG Hong-xin ,YANG Xiao-ping, ZHAO Jin，TAO Lin
(Department of Nephrology , the First Affiliated Hospital of Shihezi Medical University, Xinjiang 832000, China) Abstract
BACKGROUND: The increasing of the expression of Fibronectin played the important role in the process of the renal interstitial fibrosis .
OBJECTIVE: To investigate the expression and the effects of fibronectin (FN) in Rats
at kidney with renal interstitial fibrosis(RIF).
METHODS: seventy-two male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into normal control group （n =24） 、sham-operation group(n=24) and UUO model group(model group，n=24) by touching ball method．Rats in the model group were prepared for UUO model , the sham-operation group were only prepared for sham-operatio,and the normal chtrol group were prepared for nothing. Rats in every group were sacrificed 1，3，7 and 14 d after
operation(after model establishment for model group)(n=6 for each time)， HE staining，Masson staining，and immunohistochemical staining were used to evaluate the degree of renal tubulointerstitial fibrosis (obstructed side for model group) and detect the expression of FN 、MMP-9 and TGF-β1 in renal tissues．
RESULTS AND CONCLUSION: Histological observations of renal tissues revealed that the degree of renal tubulointerstitial fibrosis of rats in model group was significantly increased as compared with the normal group and sham-operated group after UUO ,and it was increased gradually accompanying with the increasing of degree of obstruction. It was indicated by immunohistochemical staining that the expression of protein of FN and MMP-9 of renal tissue in model group began to increase on the first day after UUO，and the expression of TGF-β1 increased on the third day after UUO，they all reached the maximum at 14th day when compared with the normal group and sham - operated group ,Significant difference was assumed at p<0.05. It was indicated that in the process of the renal interstitial fibrosis in UUO rats，the expression of protein of FN was elevated from the early stage and positively associated with fibrosis stage，and then promoted the renal fibrosis.The higher protein expression of MMP-9 might be one of reasons for inducing the renal interstitial fibrosis.
Key Words: Unilateral ureteral obstruction（UUO）model; FN; MMP-9; TGF-β1 ;Renal interstitial fibrosi 引言
近年来，大量研究证明[1,2]，各种肾脏疾病肾功能的损害程度与肾小管间质纤维化程度密切相关，肾小管间质病变程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后的最重要指标。肾间质纤维化的过程涉及多靶点、多环节、多途径，并有多种生物活性物质参与期间，其中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）产生增加和（或）降解减少所导致的ECM异常积聚，在肾小管间质纤维化的发生和进展过程中具有重要的作用[3]。探讨ECM的异常积聚，对全面认识肾间质纤维化疾病本质有着重要意义。肾脏组织中ECM的成分主要是FN、Col-Ⅳ等，降解ECM最重要的酶系之一就是基质金属蛋白酶，本文将从肾间质纤维化过程中Fn的蛋白表达变化及明胶酶（MMP-9）活性水平等进一步探讨肾间质纤维化的发病机制，以及Fn在肾间质纤维化发病中的作用及意义。 1材料和方法
设计：动物实验观察。
时间及地点：实验于2010年7月-2011年5月在新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室完成。
材料：健康雄性8周龄SD大鼠72只，体质量(200±12) g，由新疆医学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK(新)2003-0001。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准[4]。
方法：
单侧输尿管梗阻模型的建立及分组干预：将动物随机摸球法均分成正常组、假手术对照组和单侧输尿管梗阻模型组。模型组采用10%水合氯醛3.0 mL/1kg腹腔注射麻醉，在剑突下一横指处，沿腹直肌外缘处切开SD大鼠皮肤及肌层，进入腹腔，在左侧脊椎旁找到左侧肾脏，在近左肾下极处游离并进行双结扎SD大鼠左侧输尿管，造模后逐层缝合肌肉、皮肤，造模手术参见文献[5]。对照组仅开腹游离左侧输尿管，不结扎；正常组不做任何处理。3组大鼠均常规喂养，并于造模后分别在第1，3，7，14天各处死每组6只大鼠，取左侧肾脏分成2份，一份固定于体积分数10%甲醛溶液，一份置于-80℃液氮中。
肾脏病理检查：常规石蜡包埋，切片厚3μm，行苏木精-伊红（HE）染色后光镜下观察肾脏组织病理改变。计算肾间质纤维化指数(%):RIF指数=(纤维化面积/肾小管间质总面积)×100，依据RIF指数进行分级[6]。
免疫组织化学法检测肾脏组织FN、MMP-9和TGF-β1的蛋白表达：按照即用型非生物素免疫组织化学EliVisionplus试剂盒(福建迈新生物技术公司)说明书要求进行操作。兔抗鼠FN多克隆抗体、兔抗鼠MMP-9多克隆抗体，购于北京博奥森生物技术有限公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体，购于Santa Cruz公司。由二位病理科医师独立观察染色阳性细胞进行结果判定，并计算其平均值：高倍镜下（×400）随机选5个小管间质视野（避开肾小球和大血管）观察染色细胞的面积和强度，计算其平均值。染色面积：0分为无染色，1分为偶有染色，2分为局灶染色，3分为弥漫染色。染色强度：0分为无染色，1分为淡黄色，2分为黄色，3分为棕黄色。总积分1分为阴性，2-3分为弱阳性，4-5分为阳性，6分为强阳性。
主要观察指标：①肾组织病理学变化。②纤维连接白、基质金属蛋白酶-9、转化生长因子-β1的蛋白表达。②相关性分析
统计学分析：数据均采用x±s表示，应用 SPSS 13.0统计软件处理。组间及同时间点组内比较采用方差分析，FN、MMP-9、TGF-β1与肾间质病变积分之间的相关性分析采用Pearson直线相关分析，P <0.05表示差异有显著性意义。 2 结果
2.1 实验动物数量分析：实验选用SD大鼠72只，分为3组，无脱失，均进入结果分析。 2.2 肾脏病理改变：光镜下观察，HE染色，与正常组各对应时间点比较，对照组第1，3，7，14 d的肾组织未见明显异常，单侧输尿管梗阻模型组于造模后第1天在肾小血管及肾间质周围可见有少量炎性细胞呈小灶性浸润；造模后第3天模型组可见肾间质水肿，肾小管扩张，小管间质区域出现较多单核细胞、淋巴细胞浸润，并随梗阻时间的延长，肾脏损伤逐渐加重，至第14天肾小管结构严重破坏，肾小管萎缩，管腔塌陷，上皮细胞大量坏死，部分肾小管、集合管扩张呈囊状，肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生及胶原形成，肾间质纤维化明显。造模组与正常组、对照组相比，肾间质损害评分有显著性差异，见表1，图1.1-1.3，图2.1-2.3。
TM
表1 各组不同时间肾小管间质损害程度评分(x±s，RIF指数)
Table 1 tubulointerstitial damage mark in different time of each group(x±s，RIF index) t（after UUO）
1d 3d 7d 14d
UUO model 0.345±0.297 1.720±0.357 2.427±0.431 2.878±0.181 66.565 0.001
sham-operation 0.064±0.106 0.263±0.208 0.634±0.233 0.865±0.243
18.57 0.05
normal control 0.000±0.000 0.000±0.000 0.000±0.000 0.000±0.000
— —
F 5.921 84.655 58.240 46.025 — —
P
0.05 0.05 0.001 0.000 — —
F P
图1.1正常组3天 (×400) 图1.2:假手术组3天 (×400) 图1.3:UUO组3天 (×400)
Fig1.1 The change of kidney Fig1.2 The change of kidney Fig1.3 The change of kidney histopathology in normal histopathology in sham- histopathology in UUO model control group at the third operation group at the third group at the third day day(HE Stain，×400) day(HE Stain，×400) (HE Stain，×400)
图2.1正常组14天 (×400) 图2.2:假手术组14天 (×400) 图2.3:UUO组14天 (×400) Fig2.1 The change of kidney Fig2.2 The change of kidney Fig2.3 The change of kidney histopathology in normal histopathology in sham- histopathology in UUO model control group at the four- operation group at the four- group at the fourteenth teenth day(HE Stain，×400) teenth day(HE Stain，×400) day(HE Stain，×400)
2.3 大鼠肾脏组织FN、MMP-9和TGF-β1的蛋白表达：在正常组及假手术对照组肾组织中FN仅有微量表达，但模型组大鼠在造模后第1天开始，肾组织中FN表达面积即明显增多（1.43±0.08），且随着梗阻时间延长，肾组织中FN表达面积呈持续增加趋势，至UUO术后第14天FN表达达到高峰，与同期正常组、对照组相比，差异具有统计学意义（P <0.01），
见表2，图3。MMP-9蛋白在正常组及对照组肾组织中仅有极微量表达，模型组大鼠在造模后第1天肾组织中MMP-9蛋白表达即开始增加，第14天达到高峰，与同期正常组及对照组相比, 差异具有统计学意义 (P<0.001)，见表3，图4。TGF-β1在正常组及对照组肾组织中有很少量表达，模型组大鼠于造模后第3天肾组织中TGF-β1蛋白表达出现明显增加，至第14天达高峰，与同期正常组及对照组相比,具有显著性差异 (P<0.001)，TGF-β1在对照组第7天开始也有了较强表达（1.201±0.356），至第14天达到高峰，与同期正常组相比，差异具有统计学意义（P <0.01），见表3，图5。
表2 各组大鼠肾组织不同时间FN表达的比较（n=6, x±s）
Table 2 The comparison of the expression of FN in different time of each group
（n=6,x±s）
Group 1d 3d 7d 14d F P （after UUO） （after UUO） （after UUO） （after UUO）
normal control sham-operation UUO model
F P
0.18±0.05 0.43±0.17 1.43±0.08
65.833 0.000
0.21±0.02 0.60±0.13 3.37±0.15
581.413 0.000
0.23±0.01 0.93±0.35 6.10±0.41
436.503 0.000
0.19±0.07 0.60±0.18 2.47±0.163 560.593 0.000
— 5.042 414.028 — —
— 0.009 0.000 — —
UUO model765sham-operationnormal controldyeing area432101d3d7d14dFigure3 the expression of FN in renal tubule-interstitium of each group
表3 各组大鼠肾组织不同时间MMP-9表达的比较（n=6, x±s）
Table3 The comparison of the expression of MMP-9 in different time of each group
（n=6,x±s）
t（after UUO）
1d 3d 7d 14d
UUO model 1.20±0.419 3.53±0.163 4.70±0.276 5.73±0.163 381.55 0.00
sham-operation 0.47±0.121 0.53±0.082 0.53±0.141 0.62±0.179
1.17 0.347
normal control 0.45±0.176 0.45±0.122 0.45±0.152 0.46±0.121
0.02 0.996
F 14.895 1149.138 819.730 556.083 — —
P 0.00 0.00 0.00 0.00 — —
F P
UUO model765sham-operationnormal controldyeing area432101d3d 7d Figure4 the expression of MMP-9 in renaltubule-interstitium of each group14d
表4 各组大鼠肾组织不同时间TGF-β1表达的比较（n=6, x±s）
Table4 The comparison of the expression of TGF-β1 in different time of each group
（n=6,x±s）
t（after UUO）
1d 3d 7d 14d
UUO model
sham-operation
normal control 0.132±0.162 0.132±0.162 0.132±0.162 0.132±0.162
— —
F 1.332 44.294 60.673 261.531 — —
P 0.05 0.05 0.001 0.001 — —
0.315±0.193 0.231±0.233 1.902±0.483 0.303±0.350 2.512±0.504 0.868±0.243 3.701±0.274 1.201±0.356 86.894 0.001
14.137 0.001
F P
UUO model43.53sham-operationnormal controldyeing area2.521.510.501d3d7d14dFigure5 The expression of TGF-B1 in renal tubule-interstitium of each group
2.4 相关性分析：纤维连接蛋白、基质蛋白酶-9、转化生长因子β1与肾小管间质病理损害程度呈正相关关系（r= 0.899，0.934，0. 893，P<0.001）；纤维连接蛋白、基质蛋白酶-9、转化生长因子β1三者蛋白表达之间的相关关系也呈正相关关系（r= 0.962，0.902，0. 868，P<0.001）。 3 讨论
纤维连接蛋白(FN)是一种非胶原性的a2糖蛋白，其参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连;维持细胞的正常形态;作为细胞间基质,损伤后作为基质再生支架调节细胞运动,促进细胞迁移;对单核-巨噬细胞有趋化作用;参与止血与血液凝固;通过调理作用增加吞噬细胞的吞噬能力等[7]，在人体的发育、细胞分化与移行、信号转导等生理过程以及炎症损伤修复、免疫应答、肿瘤转移等病理过程中起着重要作用。这种a2糖蛋白可由成纤维细胞以及肝细胞等多种类型的细胞来合成，为细胞外基质（ECM）的主要组成成分。纤维连接蛋白能够结合纤维蛋白、纤维蛋白原及胶原，是其它胶原沉积于肾小管和间质的先决条件之一，可能是作为这些细胞外基质成分之间的中心环节而起作用，同时纤维连接蛋白也是一种重要的调理介质，其通过与整合素的结合在介导细胞增值与器官硬化过程中起着重要作用[8]。本实验研究结果显示，在正常组及假手术对照组的大鼠肾间质中FN仅有微量表达，但在模型组中,FN的蛋白表达则明显增多，且随着梗阻时间延长，肾间质纤维化(RIF)程度的加重，FN的蛋白表达持续增加。通过线性相关分析我们观察到，UUO模型组中FN的蛋白表达量与肾间质损害程度呈显著正相关，其相关系数r=0.899，P <0.001，证实了FN合成的显著增加是肾间质纤维化的主要表现，并促进了肾间质纤维化的发生发展。
我们的研究结果还发现，UUO模型组造模后第1d，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在肾小管上皮细胞中的表达即显著增加,特别在肾小球周围的肾小管上皮细胞中表达更为明显，且随着肾小管间质损害的加重，MMP-9的表达量进行性增加,并于术后第14d达高峰。这与
Kim H等[91011]的研究结果相一致。通过线性相关分析我们发现，UUO模型组中MMP-9的蛋白表达量也与肾间质损害程度呈显著正相关，其相关系数r=0.934，P <0.001。FN与MMP-9的蛋白表达量之间亦呈显著正相关，其相关系数r=0.962，明显高于其他相关比，这表明FN的蛋白表达升高与MMP-9表达升高有着密切关联。研究证实，基质金属蛋白酶及其组织
，
，
抑制物是调控ECM降解最重要的酶系[12]，基质金属蛋白酶的主要功能就是降解ECM成分。
，
国内杨晓萍等[1314]的研究证实，UUO模型大鼠术后会出现肾小管上皮细胞转分化（EMT）现象，我们推测梗阻时间越长，小管上皮细胞转分化就越多，合成的ECM就越多，刺激MMP-9代偿性增加就越严重，MMP-9蛋白表达增加促使基底膜成分降解，肾小管基底膜断裂,造成更多的肾小管上皮细胞损伤，侵袭性增强,转分化增多,随后转分化后的上皮细胞通过受损断裂的基底膜进入间质区，在肾间质合成更多的ECM，再刺激MMP-9代偿性增加……形成恶性循环，导致肾间质纤维化的迅速进展。
转化生长因子β1在模型组术后3天的肾小管间质区表达明显增加，并随着梗阻时间延长、肾间质损害程度的加重而表达进行性增加。TGF–β1是一种多效性的细胞因子，能够促使ECM的过度增加和聚积，被认为是器官纤维化过程中的核心介质，是与纤维化发生、发展密切相关的生长因子，抑制其表达或生物活性可以延缓器官纤维化进程[15]，故肾间质中TGF–β1表达增加，可以认为发生了肾间质纤维化， FN、MMP-9均与TGF –β1表达呈显著正相关，FN、MMP-9、TGF –β1的表达升高，提示FN、MMP-9均参与了肾间质纤维化过程。
肾间质纤维化的发病机制非常复杂，目前尚不十分明确，单侧输尿管梗阻引起的肾梗阻是诱导肾纤维化最经典的模型[16]，我们通过成功建立UUO模型，检测到在肾间质损害早期即出现FN、MMP-9蛋白表达的显著增加，且均与TGF –β1表达、肾间质损害程度呈正相关，r绝对值大于0.8，表明FN、MMP-9表达与TGF –β1、肾间质纤维化相关密切，FN、MMP-9表达量的变化可作为我们判断早期肾间质损害程度的重要指标，并为临床早期干预肾间质纤维化进程提供实验理论依据。 4 参考文献
[1] Rastaldi MP. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for the development of renal tubulointerstitial fibrosis.J NePhrol. 2006;19(4):407-412 [2] Okon K.Tubulo-interstitial changes in glomerulopathy.II.Prognostic Significance. Pol J Pathol. 2003;54(3):163-169.
[3] 陆海英,张悦，周娟,等. MMP-2和TIMP-2在肾间质纤维化大鼠模型中的表达和意义[J].
现代预防医学,2009,36(12):2328-2331.
[4] Adolphe M, Parodi AL. Ethical issues in animal experimentation. Bull Acad Natl Med. 2009;193(8):1803-1804.
[5] 傅淑霞，陈亚坤，王晓铃，等. 丹红注射液对单侧输尿管梗阻大鼠Ets-1、MMP-9和TIMP-1表达的影响[J]. 中国现代医学杂志2010,20(9):1284-1288
[6] 赵艳君,覃远汉,陈静,等. 抗增殖蛋白在单侧输尿管结扎大鼠肾脏组织中的表达及全反式维A酸的干预作用[J].实用儿科临床杂志,2009,24(9):682-683.
[7] 李扬宇,王智,林青. 纤维连接蛋白在慢性肾小球肾炎中的临床应用[J].齐齐哈尔医学院学报,2006,27(16):1938-1939.
[8] Li JH，Zhu HJ，HuangXR，et al.Smad7 Inhibits fibroti effect of TGF一Beta
On renal tubular ePithelial cells by bloeking Smad2 activation. J AM Soc NePhrol，2002，13(6):1464一1472.
[9] Kim H, OdaT, Lopez-GuisaJ, et a.l TIMP-1 deficiency does not attenuate interstitial fibrosis in obstructive nephropathv., JAm Soc Nephro,l 2001, 12: 736-748. [10] Khuth ST' AkaokaH, PagenstecherA, et a.l Morbillivirus infection of the mouse central nervous system induces region specific upregulation of MMPs and TIMPs correlated to inflammatory cytokine expression., Journal of Virology, 2001, 75: 8268-8282.
[11] 马丽华,刘丽秋,朱虹. 基质金属蛋白酶-9在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质的表达及干预研究 [J].泰山医学院学报,2010,31(5):341-344.
[12] White I. A, Mitchell TI. Brinckerhoff CE. Transforming growth factor beta
inhibitory element in the rabbitmatrix metalloprote inase-1(collagenase-1) gene functions as a repressor of constitutive transcription. BiophysActa, 2000, 1490(3): 259~268.
[13] 杨晓萍,林智峰,张春江,等.肾间质纤维化动物模型中整合素连接激酶及相关因子的表达 [J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(2): 258-262.
[14] 林智峰,杨晓萍,张春江,等. 整合素连接激酶和a-平滑肌肌动蛋白在肾间质纤维化动物模型中的表达及意义[J]. 实用 医 学 杂 志,2008,24(19): 3302-3305.
[15] Scaffidi AK，Petrovic N，Moodley YP，et al. Alpha (v) beta (3) Integrin interacts
with the transforming growth factor beta(TGF beta)type II receptor to potentiate the proliferative effects of TGF beta I in living human lung fibroblasts. J Biol Chem.2004;279(36):37726一37733.
[16] Picard N，Baum O，Vogetseder A，et al.Origin of renal myofibroblasts in the mSeaffidiAK，PetrovieN，odel of unilateral ureter obstruction in the rat. Histochem Cell Biol.2008:130(l):141一155.
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