第６卷第２期 ２０１６年ｏ４月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｖ＿０１．６ＮＯ．２ Ａｐｒ．２０１６ 大鼠背根神经节中卫星胶质细胞容量 激活氯电流的分子基础及机制 焦晓翠张海林 河北医科大学药理教研室，石家庄，０５００００，中国 【摘要】目的：探讨大鼠背根神经节中卫星胶质细胞容量激活氯电流的分子基础及激活机制。方法：采用全细 胞膜片钳技术记录大鼠背根神经节中卫星胶质细胞上容量激活氯电流并观察在螫合细胞内钙离子、阻断细胞膜 嘌呤受体、特异性敲低跨膜蛋白１６Ａ（ｔｒａｎｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １６Ａ，ＴＭＥＭ１６Ａ）时对该电流的影响。结果：在细 胞内高渗条件下，在大鼠背根神经节的卫星胶质细胞上可以记录到可被氯离子通道阻断剂阻断的内向电流即容 量激活氯电流。利用慢病毒载体所携载的ｓｉＲＮＡ特异性敲低ＴＭＥＭ１６Ａ可显著抑制该电流。螯合细胞内钙离 子浓度可抑制该电流的发生；阻断ＡＴＰ受体对该电流的发生无影响。结论：大鼠背根神经节的卫星胶质细胞上 存在容量激活的氯电流，其分子基础为ＴＭＥＭ１６Ａ介导的钙激活氯通道，激活机制可能与细胞内钙离子的释放 有关。 【关键词】卫星胶质细胞；容量激活氯电流；钙离子；跨膜蛋白１６Ａ 【中图分类号】Ｒ３３８．８ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．２０９５—１３９６．２０１６．０２．００１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｓｗｅｌｌｉｎｇ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｇｌｉａ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｒａｔ Ｄｏｒｓａｌ Ｒｏｏｔ Ｇａｎｇｌｉｏｎ 儿Ａ０ Ｘｉａｏ－ｃｕｉ．ＺＨＡＮＧ Ｈａｉ—ｌｉｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ，０５００００，Ｃｈｉｎａ 【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｖｏｌｕｍｅ． ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｕｒｒｅｎｔｓ（ＶＡＣＣ）ｉｎ ｔｈｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｇｌｉａ ｃｅｌｌｓ（ＳＧＣＳ）ｏｆ ｒａｔ ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ（ＤＲＧ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ＶＡＣＣ ｗａｓ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｂｙ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｏｌｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆⅥ ＣＣ．ｓｉＲＮＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ Ｏｆ ＴＭＥＭ １ ６Ａ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ Ｏｆ ＶＡＣＣ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎ ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｈａｔ ｗａｓ ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ＳＧＣｓ ｏｆ ｒａｔ ＤＲＧ．Ｔｈｉｓ ｃｕｒｒｅｎｔ，ｎａｍｅｌｙ ＶＡＣＣ，ｗａｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｗｈｅｎ ＳＧＣｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ ａｇａｉｎｓｔ ＴＭＥＭ １ ６Ａ．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＶＡＣＣ ｗａｓ ｂｌｏｃｋｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａ ｗａｓ ｃｈｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｃＯｎｃｅｎｔｒａｔｉＯｎｓ Ｏｆ ＢＡＰＴＡ ｏｒ ＥＧＴＡ．ＶＡＣＣ ｗａｓ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｗｈｅｎ Ｐ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗａｓ ｂｌｏｃｋｅｄ．Ｃｏｎｅｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＳＧＣｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ＤＲＧ ｅｘｐｒｅｓｓ ＶＡＣＣ．Ｔｈｅ ＶＡＣＣ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ．ＴＭＥＭ １ ６Ａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｐｐｅａｒ ｔｏ ｂｅ ａ ｃｒｕｃｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＶＡＣＣ ｉｎ ｒａｔ ＳＧＣｓ． 【ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ】ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｇｌｉａ ｃｅｌｌｓ；ｖｏｌｕｍｅ．ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ；Ｃａ２＋；ｔｒａｎｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １６Ａ（ＴＭＥＭ１６Ａ） 基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ－３１２７０８８２），国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（Ｎｏ．２０１３ＣＢ５３１３０２） 作者简介：焦晓翠，女，硕士；研究方向：分子药理学；Ｔｅｌ：＋８６－０１８２０３２２６０８６，Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉａｏｘｉａｏｃｕｉｖｉｐ＠１６３．ｃｏｒｎ 通讯作者：张海林，男，教授，博士，博士生导师；研究方向：分子药理学；Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｈｌ＠ｈｅｂｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ １・ 第６卷第２期 ２０１６年ｏ４月 神经药理学报 Ａｅｔａ Ｎｃｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ 、厂０１．６ＮＯ．２ Ａｐｒ．２０１６ 卫星胶质细胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｇｌｉａ ｃｅｌｌｓ，ＳＧＣｓ）是外周 神经中一种重要的神经胶质细胞，它们广泛地分布于 背根神经节（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ，ＤＲＧ）和三叉神经节 （ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉａ，ＴＧ）内。数个卫星胶质细胞通过缝 隙连接相互联系，包绕于一个或两个神经元胞体周围， 与神经元共同组成了一个功能相对独立的结构单位…。 最初人们认为卫星胶质细胞仅仅为神经元提供结构 支撑、营养支持，从而促进神经元的生长发育。近来研 究发现，卫星胶质细胞之间的缝隙连接以及其本身 表达的钾离子通道对神经元周围环境的维持具有重要 作用 。因此，卫星胶质细胞对神经元生理和病理状 态的影响成为研究者关注的焦点 。另外卫星胶质细 胞还表达有多种神经递质的受体，它们参与了卫星胶 质细胞与神经元之间的信息交流，对神经元的兴奋性 产生了影响 Ｊ。其中，谷氨酸作为一种重要的兴奋性神 经递质，很可能是神经元与胶质细胞进行交流的一种 化学递质之一。阐明神经胶质细胞与神经元相互作用 的机制有助于进一步了解神经元兴奋性的调节机制， 并且为神经病理性疼痛等相关神经系统疾病的治疗提 供新的途径。 氯离子通道是体内最重要的阴离子通道，广泛分 布于各种组织，参与机体各种病理和生理过程。氯离子 通道可以分为六大类：电压门控氯通道，囊性纤维化跨 膜转运调节因子氯离子通道，容积调控阴离子通道，钙 激活氯通道，配体门控氯通道以及线粒体相关氯通道 家族 。其中的容积调节性氯离子通道又称为容量依 赖性外向整流阴离子通道（ｖｏｌｕｍｅ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｏｕｔｗａｒｄｌｙ ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ，ＶＳＯＲ）…。细胞容积的变 化会激活这种通道，从而导致氯离子的跨膜流动，产 生氯电流，即容量激活氯离子电流（ｖｏｌｕｍｅ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｕｒｒｅｎｔ，ＶＡｃｃ）。ＶＡＣＣ已被证实存在于大多 数哺乳动物体的组织与细胞中，现已在人类的气管、肾 脏、胃肠道和鼻腔上皮细胞及多种组织的表皮细胞、成 纤维细胞、角质细胞、神经胶质细胞中发现该通道 。 在物种的进化过程中，为了保持细胞体积及细胞内溶 质的稳定性，细胞自身体积的调控便成为了细胞得以 生存的必不可少的一项功能。容量激活的氯通道对细 胞体积的维持发挥着巨大的作用 Ｊ。另外，越来越多 的研究发现容量调节的氯电流还参与了许多其他重要 的生理调控过程，如细胞体积的维持，ｐＨ的调控，静息 膜电位的维持，并且可以影响细胞的增殖和分化¨。。“ 。 有学者研究发现，中枢神经中的小胶质细胞上存在着 容量激活的氯电流，并且其对细胞内的一些有机质如 牛磺酸、谷氨酸和天门冬氨酸等的调节性释放有重要 作用 川。ＶＡＣＣ介导的谷氨酸释放可能通过影响神经 元的兴奋性而导致一系列神经系统的病变。 虽然容量激活氯电流的功能已经越来越多地受到 人们的关注和认识，但是对其分子组成、激活机制等的 认识还不够充分，需要进行更全面的研究。Ｊｏａｎａ等 发现上皮细胞上容量激活氯电流的激活依赖于跨膜蛋 白１６Ａ（ｔｒａｎｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １６Ａ，ＴＭＥＭ１６Ａ），可 见ＴＭＥＭ１６Ａ蛋白可能是上皮细胞中容量激活氯通道 的关键成分，并且可能在细胞的分化和凋亡中发挥着 关键作用Ｌ１ 。最近富含亮氨酸重复蛋白（１ｅｕｃｉｎｅ．ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ．ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，ＬＲＲＣ）被认为是构成ＶＡＣＣ的分子 基础¨ 。此外，一些学者还提出了调控容量激活氯通 道的诸多因素，如Ｇ蛋白途径，磷酸化反应包括Ｃａ ／ 钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶ｃ、蛋白激酶Ａ、 酪氨酸激酶，细胞骨架等¨ 。 。对这些问题的研究可 以使我们更好地认识容量激活的氯通道，为相关疾病 的治疗靶点寻找新的突破口。本实验将研究大鼠背根 神经节卫星胶质细胞上的ＶＡＣＣ，并初步鉴别其分子基 础及激活机制。 １材料与方法 １．１实验材料 １．１．１动物及病毒 ＳＤ乳大鼠，７～１０ ｄ龄，由河北医科大学实验动物 中心提供。敲低ＴＭＥＭＩ６Ａ的ｓｉＲＮＡ慢病毒，购自上 海吉凯基因化学技术有限公司。 １．１．２药品与试剂 ＤＭＥＭ细胞培养基，购自美国ＧＩＢＣＯ公司； ０．０５％胰酶，购自美国Ａｍｅｒｓｃｏ公司；青链霉素，购 自索来宝生物制品有限公司；胎牛血清，购自ＰＡＡ公 司；ＨＢＳＳ，购自美国ＧＩＢＣＯ公司；胶原酶Ⅱ，购自美 国Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ公司；ＨＥＰＥＳ、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、 ＣｓＣ１２、ＥＧＴＡ、Ｎａ２ＡＴＰ、ＧＴＰ—Ｔｒｉｓ、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ、鞣酸、 ＢＡＰＴＡ，均购自美国Ｓｉｇｍａ公司。 １．１．３主要仪器 ２００Ｂ膜片钳放大器，美国Ａｘｏｎ公司；１３２２Ａ膜片 钳数模转换器，美国Ａｘｏｎ公司；ＭＰ．２５５微操纵器，美 国Ｓｕｔｔｅｒ公司；Ｍｏｄｅｌ Ｐ一９７微电极拉制仪，美国ＳｕＲｅｒ 公司。 １．２实验方法 １．２．１ ＤＲＧ神经元与卫星胶质细胞混合培养 取７～１０ ｄ龄ＳＤ乳鼠，断头后，在肉眼下暴露其 椎管及椎间孔。利用显微解剖镊逐个摘出椎间孔内 背根神经节，并尽量去除其连接纤维，立即置于冰冷 的Ｄ—Ｈａｎｋｓ液中。全部摘除完毕后，移入１ ｍＬ胶原 酶（１ ｍｇ・ｍＬ ）＋Ｄｉｓｐｅａｓ酶（７．５ ｍｇ・ｍＬ ）消化液中并 第６卷第２期 ２０１６年ｏ４月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ 、，０１．６ＮＯ．２ Ａｐｒ．２０１６ 用显微剪刀剪碎，３７￣Ｃ，５％ＣＯ 培养箱中消化３０ ｍｉｎ。 完毕后，将ＤＲＧ组织块移入用含有１０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ培养基清洗３次，终止消化，１ ５００ ｒ・ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ。离心完毕，弃上清液，加入２ ｍＬ含有１０％胎牛 血清的ＤＭＥＭ全培养基，用滴管轻轻吹散，打成细胞 悬液，种植在预先用多聚赖氨酸包被的盖玻片上，并置 于３７ｃｃ，５％ＣＯ 培养箱中培养４ ｈ。完全贴壁后，补加 培养基，４８ ｈ后使用。培养的细胞在３～５ ｄ内使用。 １．２．２卫星胶质细胞的分离与培养 背根神经节提取和酶消化如上述，与上述不同之 处在于消化后置于３７℃，５％ＣＯ 培养箱中培养２ ｈ，而 不是４ ｈ。２ ｈ后，卫星胶质细胞贴壁而神经元未贴壁， 此时轻轻将培养基吸走换以新鲜培养基。完全贴壁后， 补加培养基，４８ ｈ后使用。培养的细胞在３ ５ ｄ内使用。 １．２．３膜片钳电生理实验 卫星胶质细胞电流的记录采用全细胞膜片钳 （ｗｈｏｌｅ—ｃｅｌ１）方法进行记录，所用记录电极电阻为 ２．５～３．５ ｍ１２。记录卫星胶质细胞中容量激活氯电流 所用电压刺激程序为：一６０ ｍＶ钳制电压下不间断记录 ｈｏｌｄｉｎｇ电流，期间以１５ Ｓ间隔记录爬坡（ｒａｍｐ）电压刺 激程序诱导的电流；ｒａｍｐ程序为：一６０ ｍＶ钳制１００ ｍｓ； ｒａｍｐ：一１００ ｍＶ到＋１００ ｍＶ，时间为５０ ｍｓ，之后电压 恢复至一１００ ｍｓ钳制５００ ｍｓ。 １．２．４电生理实验液体的配制 １．２．４．１ 正常渗透压电极内液：ＣｓＣ１２ １４０．００ ｍｍｏｌ・ Ｌ～，ＭｇＣ１２ ２．４０ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＣａＣ１２０．５０ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＥＧＴＡ ５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＨＥＰＥＳ １０．００ ｍｍｏ｜・Ｌ一，Ｎａ２ＡＴＰ ５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＧＴＰ．Ｔｒｉｓ ０．３３ ｍｍｏｌ・Ｌ～，用Ｃｓ（ＯＨ）， 调节ｐＨ至７．３～７．４，用蔗糖调至３２０ ｍＯｓｍｏｌ・Ｌ～，分 装，一２０℃保存。 １．２．４．２ ＣｓＳＯ，高渗电极内液：ｃｓｓｏ４７０．Ｏ０ｍｍｏｌ・Ｌ－ ，ＭｇＣｈ ２．４０ ｍｍｏｌ・Ｌ－１ ＣａＣｈ ０．５０ ｍｍｏｌ・Ｌ－ ，ＥＧＴＡ ５．００ ｍｍｏｌ・１７ 。 ＨＥＰＥＳ １０．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，Ｎａ２ＡＴＰ ５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ－ ，ＧＴＰ．Ｔｒｉｓ ０．３３ ｍｍｏｌ・Ｌ～，用Ｃｓ（ＯＨ）２调节ｐＨ至７．３～７．４，用蔗糖调 至４２０ ｍＯｓｍｏｌ・Ｌ一，分装，一２０￣Ｃ保存。 １．２．４．３ ＣｓＣ１２高渗电极内液：ＣｓＣ１ １４０．００ ｍｍｏｌ・ Ｌ～，ＭｇＣ１２ ２．４０ ｍｍｏｌ・Ｌ＿。，ＣａＣ１２ ０．５０ ｍｍｏｌ・Ｌ～， ＥＧＴＡ ５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＨＥＰＥＳ １０．００ ｍｍｏｌ・Ｌ。。，Ｎａ２ＡＴＰ ５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＧＴＰ．Ｔｒｉｓ ０．３３ ｍｍｏｌ－Ｌ～，用Ｃｓ（０Ｈ）， 调节ｐＨ至７．３～７．４，用蔗糖调至４２０ ｍＯｓｍｏｌ・Ｌ～，分 装，一２０℃保存。 １．２．４．４高渗、高ＢＡＰＴＡ电极内液：ＣｓＣ１，１４０．００ ｍｍｏｌ・ Ｌ～，ＭｇＣ１２ ２．４０ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＣａＣ１２０．５０ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＥＧＴＡ ５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＢＡＰＴＡ２０．００ ｍｍｏｌ・Ｌ－ ，ＨＥＰＥＳ １０．００ ｍｍｏｌ・ Ｌ～，Ｎａ，ＡＴＰ ５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＧＴＰ．Ｔｒｉｓ Ｏ．３３ ｍｍｏＩ．Ｌ～． 用Ｃｓ（ＯＨ） 溶液将ｐＨ调节至７．３～７．４，用蔗糖将内液 渗透压调至４２０ ｍＯｓｍｏｌ・Ｌ～，一２０℃保存。 １．２．４．５高渗、高ＥＧＴＡ内液：ＣｓＣ１２ １４０．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～， ＭｇＣ１２ ２．４０ ｍｍｏｌ Ｌ一，ＣａＣ１２ ０．５０ ｍｍｏｌ‘Ｌ～，ＥＧＴＡ ２５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ一，ＨＥＰＥＳ １０．００ ｍｍｏｌ・Ｌ一，Ｎａ２ＡＴＰ ５．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＧＴＰ．Ｔｒｉｓ ０．３３ ｍｍｏｌ・Ｌ～，用Ｃｓ（ＯＨ）２调 节ｐＨ至７．３～７．４，用蔗糖调至４２０ ｍＯｓｍｏｌ・Ｌ～，一２０ ｏＣ 保存。 １．２．４．６ 细胞外液：ＮａＣ１ １４５ ００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＫＣ１ ５．Ｏ０ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＭｇＣ１２ ２．００ ｍｍｏｌ－Ｌ～，ＣａＣ１２ ２．００ ｍｍｏｌ・ Ｌ～，ｇｌｕｃｏｓｅ １０．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，ＨＥＰＥＳ １０．００ ｍｍｏｌ・Ｌ～，用 ＮａＯＨ调节ｐＨ至７．３～７．４，用蔗糖调至３２０ ｍＯｓｍｏｌ・Ｌ一。 １．２．５针对ＴＭＥＭ１６Ａ的ｓｉＲＮＡ的慢病毒构建及细 胞转染 敲低ＴＭＥＭ１６Ａ的ｓｉＲＮＡ慢病毒载体为Ｕ６一 ＭＣＳ—Ｕｂｉ—ＥＧＦＰ。按前述方法分离乳鼠卫星胶质细胞， 待细胞生长至５０％时，向培养基中加入病毒进行细胞 转染。 转染方法：首先预混病毒，取含有双抗和胎牛血清 的ＤＭＥＭ培养基１ ｍＬ，分别加入１０ Ｌ的ｓｉＲＮＡ病 毒和ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ病毒，混匀；吸走细胞培养板中原 来的培养基，加入预混的含有病毒的培养基。将细胞放 入３７℃培养箱中继续培养，转染７２ ｈ后细胞可用于后 续实验。 １－３统计学方法 电生理数据采集使用Ｃｌａｍｐｌ０．３、Ｃｌａｍｐｆｉｔｌ０．０数 据分析与图像处理使用Ｃｌａｍｐｆｉｔ１０．０结合Ｏｒｉｇｉｎ ７．５ 及Ａｄｏｂｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ １０。实验数据以均数±标准差 （ －１－ ）表示，两组间数据比较使用两样本组问均数ｔ检 验或者两样本ｔ检验，以 ≤０．０５为标准两组间差异有 显著统计学意义。 ２结果 ２．１ 大鼠背根神经节卫星胶质细胞上表达容量激活的 氯离子电流 全细胞膜片钳实验结果表明，在使用高渗电极内液 及钳制电压为一６０ ｍＶ条件下，全细胞模式建立后随时 间可以观察到逐渐发展的内向电流（Ｆｉｇ．１Ａ）。在此基础 上，给与缓激肽（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ，ＢＫ）（１ＯＯ ｎｍｏｌ・Ｌ ）进一步 使内向电流增加。氯离子通道阻断剂鞣酸（ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ， ＴＡ）１００ ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ 可以阻断该电流（Ｆｉｇ．１Ａ）。将高渗细 胞内液ＣｓＣ１ 中的Ｃｌ一用ＳＯ 一代替后，上述电流消失， 而且，ＢＫ激活的电流也被抑制（Ｆｉｇ．１Ｂ）。在正常渗透 压的电极内液条件下未记录到这种电流（结果未给出）。 上述结果表明在大鼠ＤＲＧ的ＳＧＣｓ存在ＶＡＣＣ。 第６卷第２期 ２０１６年Ｏ４月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ＂ｃａ Ｂ ＴＡ ＢＫ ＢＫ 、幻１．６ＮＯ．２ Ａｐｒ．２０１６ Ａ ＣｓＣ１２ ＣｓＳＯ４ Ａ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＢＫ ＿－－＿一一 Ｂ ｈｉｇｈＢＡＰＴＡ Ｃ ｈｉｇｌＩＥＧＴＡ ＴＡ 。＿＿一一 ＴＡ ＢＫ －＿一ＴＡ ＢＫ ㈩‘■■量 ㈩ ■■＿ｌ＿ Ｃ ４００ ３００ ｌ ２０ｏ １００ 害 ０ 一 ｑ一葛 鲁０ 旨；目ＨＦｉｇ．１ Ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）ｉｎｄｕｃｅｓ ＣＩ一－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｉｎ ｒａｔ ＳＧＣＳ Ａ．Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｒａｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｒａｔ ＳＧＣ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣｓＣ１２．Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｒａｃｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ａｔ ａ ｈｏｌｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ－６０ ｍＶ． Ｄｏｔｔｅｄ ｌｉｎｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｚｅｒｏ ｃｕｒｒｅｎｔ ｌｅｖｅ１．Ｔｉｍｅ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｒａｄｙｋｉｎｉｎ（ＢＫ，１００ ｎｍｏｌ・Ｌ ）ａｎｄ ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ（ＴＡ，１００ ｗｍｏｌ・Ｌ。）ｗａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｂｌａｃｋ ｂａｒｓ． Ｂ．Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ＣｓＣ１２ ｗｉｔｈ ＣｓＳＯ４ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｍｅ ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ． Ｃ．Ｓｕｍｍａｒｙ ｄａｔａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｗｏ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂ． Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ。“Ｐ＜０．０１ ｗ ＣｓＣｌ，． ２．２卫星胶质细胞上ＶＡＣＣ激活与细胞内钙离子的释 放有关 将高渗细胞内液中的低浓度（５．０ ｍｍｏｌ・Ｌ ）的 依他酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓ（ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｎｉｔｒｉ１ｏ）ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＥＧＴＡ）用高浓度的钙螯合剂水合钠盐，（１，２－ｂｉｓ （２－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｘｙ）－ｅｔｈａｎｅ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ＇－ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｅ ａｃｉｄ， ＢＡＰＴＡ）（２０．０ ｍｍｏｌ・Ｌ ）或高浓度的ＥＧＴＡ（２５．０ ｍｍｏｌ・Ｌ ）替代后，上述一６０ ｍＶ ｈｏｌｄｉｎｇ电压下所记录 到的内向电流分别下降了９６．９％±２．５％（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１， ＝９） 和８０．８％±１７．２％（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１， ＝８）（Ｆｉｇ．２）。 ２．３ Ｐ２ＡＴＰ受体阻断剂对ＶＡＣＣ的影响 在卫星胶质细胞上，待容量激活的氯电流ＶＡＣＣ ．４・ ＾＊～ Ｄ （１０） （８） ０＿｝■一｝● ■■＿ ■＿ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｈｉｇｈ ＢＡＰＴＡ ｈｉｇｈ ＥＧＴＡ Ｆｉｇ．２ ＶＡＣＣｓ ａｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ａ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒ Ｃａ Ａ．Ｔｈｅ ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５．０ ｍｍｏｌ－Ｌ～ＥＧＴＡ（ｃｏｎｔｒｏ１）． Ｂ．Ｔｈｅ ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｅ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５．０ ｍｍｏ１．Ｌ～ＥＧＴＡ ａｎｄ ２０．０ ｍｍｏ卜Ｌ ＢＡＰＴＡ． Ｃ．Ｔｈｅ ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２５．０ ｍｍｏｌ‘Ｌ～ＥＧＴＡ． Ｄ．Ｓｕｍｍａｒｙ ｄａｔａ ｆｏｒ Ａ．Ｂ ａｎｄ Ｃ． ＪＰ≤０．０１ ｗ ｃｏｎｔｒｏ１． Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ． 稳定后，给予１００ ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ 的苏拉明（ｓｕｒａｍｉｎ），电流 与给药之前相比下降了３４．５％±４６．３％（Ｐ＝０．０８４，，ｚ＝５） （Ｆｉｇ．３）。 ２．４ ＴＭＥＭ１ ６Ａ可能是构成ＶＡＣＣ的分子基础 上述结果表明，大鼠ＳＧＣｓ中的ＶＡＣＣ可能是 ｃａ２＋激活的氯通道（ｃａｌｃｉｕｍ．ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ， ＣａＣＣ）。我们前期的工作¨ 表明由ＴＭＥＭ１６Ａ构成的 ＣａＣＣ可以被ＢＫ激活。为验证ＳＧＣｓ中的ＶＡＣＣ的分 子基础可能是ＴＭＥＭ１６Ａ，我们观察了针对ＴＭＥＭ１６Ａ 的ｓｉＲＮＡ对ＶＡＣＣ的影响。结果可见，相对于转染 ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ的细胞而言，转染ＴＭＥＭ１６Ａ特异 ｓｉＲＮＡ的细胞的ＶＡＣＣ明显降低，电流幅度下降了 ７９．６％４－１０．０％（Ｐ＜０．０１，刀＝８）（Ｆｉｇ．４）。 ３讨论 本实验利用膜片钳技术探索了外周神经元ＤＲＧ 的ＳＧＣｓ上是否存在ＶＡＣＣ及其分子基础。实验结果 第６卷第２期 ２０１６年０４月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｖｌ０１．６ＮＯ．２ Ａｐｒ．２０１６ Ａ ｗａｓｈ Ｂ ｓ ： ＿ＴＡ ・—－一 一 吾 芒 墨 舌 茎 Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｕｒａｍｉｎ Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｒａｍｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ＶＡＣＣ Ａ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｒａｍｉｎ（１００．０ ｉｘｍｏｌ・Ｌ ）ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｗａｒｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｂ．Ｓｕｍｍａｒｙ ｄａｔａ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｕｌＴｅｎｔ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒａｍｉｎ．Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ． Ａ Ｂ ＴＡ ＴＡ 墅ｒ一旦 １８０ｓ Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ ＴＭＥＭ１６Ａ ｓｉＲＮＡ Ｃ 二 苫 ｇ 舌 耋 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ａｇａｉｎｓｔ ＴＭＥＭ１６Ａ ｏｎ ＶＡＣＣｓ Ａ．Ｉｎｗａｒｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｒａｔ ＤＲＧ ＳＧＣＳ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡ． Ｂ．Ｉｎｗａｒｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｒａｔ ＤＲＧ ＳＧＣＳ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＭＥＭ ｌ ６Ａ ＳｉＲＮＡ． Ｃ．Ｓｕｍｍａｒｙ ｄａｔａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂ． Ｐ≤Ｏ．Ｏ１：ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ． 表明在大鼠ＤＲＧ的ＳＧＣｓ确实存在ＶＡＣＣ，高渗细胞 内液导致的细胞体积肿胀诱发大的内向电流，且这一 电流依赖丁细胞内Ｃｒ的存在，并可以被氯通道阻断剂 鞣酸阻断。 大鼠ＳＧＣｓ中的ＶＡＣＣ的激活可能与细胞内钙的 升高有关。有相关文献报道细胞内钙离子可能是调控 ＶＡＣＣ的一个重要凶素¨ ，在本研究中，我们试 验证 细胞内钙离子与ＶＡＣＣ的关系 ＢＡＰＴＡ和ＥＧＴＡ是 游离钙离子的螫合剂。ＢＡＰＴＡ对钙离子的螯合率要高 丁ＥＧＴＡ。将高渗内液中低浓度的ＥＧＴＡ分别替换为 高浓度的ＢＡＰＴＡ和高浓度的ＥＧＴＡ时，ＶＡＣＣ明显减 小，且ＢＡＰＴＡ对ＶＡＣＣ的抑制作用大丁ＥＧＴＡ。说明 ＶＡＣＣ的激活可能与细胞内钙离子的释放相关，阻断细 胞内的钙离子的释放可以阻止ＶＡＣＣ的激活。 近来．有实验室 ｓｎｉｆｆｅｒ ｐａｔｃｈ记录到，神经元胞 体在受到刺激时可以释放ＡＴＰ，ＡＴＰ作用丁胶质细胞 膜上嘌呤受体升高细胞内钙¨ 我们观察到嘌呤受体 的阻断剂苏拉明（ｓｕｒａｍｉｎ）确实可以抑制ＶＡＣＣ，虽然 统计学差异无显著性（Ｐ＝０．０８４。ｎ＝５），推测嘌呤受体激 活引起的细胞内钙升高并不是ＶＡＣＣ激活的主要方式， 但是这种方式引起的细胞内钙的升高可能小部分的参 与了ＶＡＣＣ的激活 但不排除ＳＧＣｓ的激活与ＡＴＰ释 放及嘌呤受体激活有关。 ＬＲＲＣ 、ＴＭＥＭ１６Ａ、ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｅ氯离子通道 ‘ 等都曾被报道与ＶＡＣＣ的形成有关。用ｓｉＲＮＡ慢病毒 特异性敲低ＳＧＣｓ上的ＴＭＥＭ１６Ａ后ＶＡＣＣ的电流 著下降，说明在大鼠ＳＧＣｓ上ＶＡＣＣ的分子基础可能 与ＴＭＥＭ１６Ａ有关。 总结上述实验．证实了在大鼠背根神经节的卫星 胶质细胞上存在着容积激活的氯离子通道，并发现其 激活依赖于细胞内钙离子的存在，这些钙离子可能主 要是来源丁细胞内钙的释放，比如引起其激活的钙离 子小部分可能是来自于ＡＴＰ激活嘌呤受体从而导致的 细胞内钙释放，但这一结论尚不能十分确定，还需要进 一步实验加以验证。另外，还对卫星胶质细胞上这种容 量激活的氯离子通道的分子基础进行了初步探索，并 认为钙激活氯通道的分子基础ＴＭＥＭｌ６Ａ也可能是容 量激活氯通道的分子基础ｊ至了ＬＲＲＣ、ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ等 在ＳＧＣｓ的ＶＡＣＣ形成中的作片ｌ还需要进一步的实验 进行验证。 参考文献 【１】 Ｅｎｎｉｏ Ｐａｎｎｅｓｅ．Ｔｈｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｎｇｌｉａ【ＪＪ］ ＡｄｖＡｎａｔ Ｅｍｂｒｙｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９８１，６５：１—１１１． 【２］ Ｃａｓｔｉｌｌｏ Ｃ，Ｎｏｒｃｉｎｉ Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｌ Ａ，ｅｔ ａｌ ・５ 第６卷第２期 ２０１６年Ｏ４月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｎｎａｃｏｌｏｇｉｃａ 、，０１．６ Ｎｏ．２ Ａｐｒ．２０１６ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｇｉｌａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，２４０：１３５—１４６． 【３】 Ｐｅｔｅｒ Ｔ Ｏｈａｒａ，Ｊｅａｎ—Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｖｉｔ，Ａｄｉｔｉ Ｂｈａｒｇａｖａ，ｅｔ ａ１． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｎｎｅｘｉｎ ４３ ｉｎ ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｐａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ［Ｊ】．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，１Ｏ０（６）： ３０６４—３０７３． 【４】 Ｍａｍｏｒｕ Ｔａｋｅｄａ，Ｍａｓａｙｕｋｉ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍａｓａｎｏｒｉ Ｎａｓｕ， ｅｔ ａ１．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｉｎｗａｒｄ ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｏｆ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉａ［Ｊ］．Ｐａｉｎ，２０Ｉｌ，Ｉ５２（９）：２１４７—２ｌ５６． 【５】 Ｌｉｎｇ－Ｈｓｕａｎ Ｋｕｎｇ，Ｇｏｎｇ Ｋｅ—ｒｕｉ，Ｍａｒｙ Ａｄｅｄｏｙｉｎ，ｅｔ ａ１． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｓ ａ ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｗｉｔｈｉｎ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｎｇｌｉａ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１ ３，８（７）：ｅ６８３１２． ［６】 Ｃｈａｒｉｔｙ Ｄｕｒａｎ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｈ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｘｉａｏ Ｑｉｎｇ—ｈｕａｎ， ｅｔ ａ１．Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ：ｏｆｔｅｎ ｅｎｉｇｍａｔｉｃ，ｒａｒｅｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ［Ｊ１． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１０，７２：９５・１２１． ［７］ Ｎｉｌｉｕｓ Ｂ，Ｏｉｋｅ Ｍ，Ｚａｈｒａｄｎｉｋ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃ１一 ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｙ ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ ｖｏｌｕｍｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ［ＪＪ．Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９４，ｌ０３（５）：７８７—８０５． ［８】 Ｎｉｌｉｕｓ Ｂ，Ｄｒｏｏｇｍａｎｓ Ｇ．Ａｍａｚｉｎｇ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ，２００３，１７７（２）：１１９—１４７． ［９】 Ｍ Ｅ Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒａｎｇｅ．Ａｎｉｓｏｓｍｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｖｉｅｗ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１ ９８９，２５７（２ Ｐｔ １）：Ｃｌ ５９一Ｃｌ７３． ［１０】 Ｔｈｏｍａｓ Ｖｏｅｔｓ，Ｇｅｚａ Ｓｚｕｃｓ，Ｇｕｙ Ｄｒｏｏｇｍａｎｓ，ｅｔ ａ１．Ｂｌｏｃｋｅｒｓ ｏｆ ｖｏｌｕｍｅ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｌ—ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅＩ１ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ，１９９５，４３１（１）：１３２・１３４． Ｃｌａｕｄｉａ Ｅｄｅｒ，Ｒｏ１ｆ Ｋｌｅｅ，Ｕｗｅ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔｒｅｔｃｈ．ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ［Ｊ１．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９８，ｌ８（１８）：７１２７—７１ ３７． ［１２］ Ｌｙａｎｎｅ Ｃ Ｓｃｈｌｉｃｈｔｅｒ，Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｌｉｕ Ｂａｏ—ｓｏｎｇ． Ｓｗｅｌｌｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＩ—ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ：Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ， ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ【Ｊ】．Ｃｈａｎｎｅｌｓ （Ａｕｓｔｉｎ）．２０１１，５（２）：Ｉ２８．１３７． 【１３１ Ｊｏａｎａ Ａｌｍａｃａ，Ｔｉａｎ Ｙｕｅ—ｍｉｎ，Ｆａｄｉ Ａｌｄｅｈｎｉ．ｅｔ ａ１．ＴＭＥＭ １ ６ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅ ｖｏｌｕｍｅ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ＴＭＥＭＩ６Ａ【Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００９， ２８４（４２）：２８５７１．２８５７８． 【１４】 Ｆｅｌｉｚｉａ Ｋ Ｖｏｓｓ，Ｆ１ｏｒｉａｎ Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｊｏｎａｓ Ｍｕｎｃｈ， ｆ口，． Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＲＲＣ８ ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｓ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ＶＲＡＣ【Ｊ】．Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２Ｏｌ４，３４４（６ｌ８４）：６３４．６３８． 【１ ５】 Ｌｏｉｃ Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ．Ｎａｔａｌｉａ Ｐｒｅｖａｒｓｋａｙａ，Ｙａｒｏｓｌａｖ Ｓｈｕｂａ， ｅｔ ａ１．Ｃａ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｌｕｂｌｅ．ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｔｏｒｅ—ｏｐｅｒａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ】． ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００２，ｌ６（２）：２２２—２２４． 【１６】 Ｈａｌｌ Ｓ Ｋ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｍ，Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｗｅｌｌｉｎｇ・－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ・・ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｉｃｋ ｈｅａｒｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９５，４８８（Ｐｔ ２）：３５９－３６９． ［１７】 Ｙｕｈｋｏ Ａｎｄｏ—Ａｋａｔｓｕｋａ．Ｉｓｋａｎｄａｒ Ｆ ＡｂｄｕＩｌａｅｖ．ＥＩｂｅｒｔ Ｌ Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ Ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｌｕｍｅ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃ１一ｃｈａｎｎｅｌｓ ｂｙ ＣＦＴＲ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ［Ｊ］＿Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ，２００２，４４５（２）：１７７－１８６． ［１８】 Ｌｉｕ Ｂｏ—ｙｉ，Ｊｏｈｎ Ｅ Ｌｉｎｌｅｙ，Ｄｕ Ｘｉａｏ—ｎａ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｉｎ ｒａｔ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｒｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ—ｔｙｐｅ Ｋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ 一ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＩ ｃｈａｎｎｅｌｓ【Ｊ】．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２Ｏｌ０．１２０（４）：ｌ２４０一ｌ２５２． 【Ｉ９】 Ｓｔｅｆａｎｉａ Ｃｅｒｕｔｉ，Ｍａｒｔａ Ｆｕｍａｇａｌｌｉ，Ｇｉｏｖａｎｎｉ Ｖｉｌｌａ，ｅｔ ａｔ． Ｐｕｒｉｎｏｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎ・ ｇｉｌａ ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ【Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，２００８，４３（６）：５７６— ５９０． ［２０】 Ｑｉｕ Ｚｈａｏ・ｚｈｕ，Ａｄｒｉｅｎｎｅ Ｅ Ｄｕｂｉｎ，Ｊａｙａｎｔｉ Ｍａｔｈｕｒ，ｅｌ ａ１． ＳＷＥＬＬ １。ａ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｖｏｌｕｍｅ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ【Ｊ】．Ｃｅｌｌ， ２０１４．１ ５７（２）：４４７．４５８． 【２１】 Ｋａｒｌ Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ．ＴＭＥＭ１６，ＬＲＲＣ８Ａ，ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ Ｃａ（２＋）ａｎｄ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ【Ｊ】．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２Ｏｌ５．４０（９）：５３５－５４３．