山东农业科学２０１１，３：１０３～１０５ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白型的研究 骆延波 ，刘 霞¨，黄迪海 ，张从敬 ，刘晓飞 ，张 华 ，徐秀荣‘，张再辉 （Ｉ．山东省健牧生物药业有限公司，山东济南２５０１００；２．莱州市畜牧兽医站，山东莱州２６１４００） 摘要：对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（ＡＰＰ）１２个血清的外膜蛋白型进行了测定。用Ｎ一十二烷酰肌 氨酸法提取其主要外膜蛋白（ＯＭＰｓ），经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳后，用考马斯亮兰法进行染色，结果ＡＰＰ １２个血清 型的ＯＭＰ可以分为６个ＯＭＰ型，表明ＡＰＰ的ＯＭＰ具有多样性。 关键词：胸膜肺炎放线杆菌；外膜蛋白型；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 中图分类号：￥８５２．６１ ９ 文献标识号：Ａ 文章编号：１００１—４９４２（２０１１）０３一（、１ｎ３—０３ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｉｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＬＵＯ Ｙａｎ—ｂｏ ，ＬＩＵ Ｘｉａ ’，ＨＵＡＮＧ Ｄｉ—ｈａｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｃｏｎｇ—ｊｉｎｇ ， ＬＩＵ Ｘｉａｏ—ｆｅｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｈｕａ ，ＸＵ Ｘｉｕ—ｒｏｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｚａｉ—ｈｕｉ （１．Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｊｉａｎｍｕ Ｂ Ｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊ／ｎａｎ ２５０１００，Ｃｈｉａｎ； ２．Ｌａｉｚｈｏｕ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆＳｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｉｚｈｏｕ ２６１４００，Ｃｈｉａｎ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＯＭＰｓ）ｏｆ ｔｗｅｌｖｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ （ＡＰＰ）ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｒｏｕｇｈｌｙ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｂｙ Ｎ—Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｅｏｓｉｎｅ．Ａｆｔｅｒ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎｄ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｃｏｍ— ｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ，ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｓｅｍｔｙｐｅｄ ｔｏ ｓｉｘ ｐａｔｔｅｒｎｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ＯＭＰ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｔｙ ｏｆ ＡＰＰ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｎｉａｅ；Ｏｕｔｅｒ ｍｅｎｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｔｔｅｒｎ；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 猪传染性胸膜肺炎（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｌｅｕ— 主要ＯＭＰｓ的亚单位在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ中的分子量 ｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）是由胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌ－ 为２９、３９、５０、７６ ｋｕ［２］，分别为质粒编码蛋白 ｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）引起的以胸膜肺炎和 （ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＣＰ）、ｏｍｐ Ａ蛋白（ｏｍｐ 出血性坏死性肺炎为特征的一种高度传染性和致 Ａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｋ蛋白（Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）和微孑Ｌ蛋白（ｐｏｒ－ 死性的呼吸系统疾病。ＡＰＰ引起猪致病有几个毒 ｉｎｓ） ３。。 力因素，包括荚膜多糖（ＣＰ）、脂多糖（ＬＰＳ）、外膜 根据是否依赖ＮＡＤ可将ＡＰＰ分为两个生物 蛋白（ＯＭＰ）、转铁结合蛋白（Ｔｂｐ）、蛋白酶、渗透 型：生物Ｉ型和生物Ⅱ型。根据ＡＰＰ的荚膜抗原 因子（ＰＦ）及溶血素（Ｈｌｙ）等。小鼠进行免疫保护 和细菌脂多糖的不同，又将生物Ｉ型分为ｌ２个血 试验表明，任何一种单一的抗原，包括溶血素在内 清型（生物１型～生物ｌ２型）。目前，国内对ＡＰＰ 以及ＣＰ、ＬＰＳ和ＯＭＰ都只能提供部分的保护力， 的这１２个血清型外膜蛋白的研究还未见报道，笔 而不能诱导完全的保护。研究显示外膜蛋白除上 者对其进行了初步的研究。 述免疫保护作用外，还在猪白细胞的吞噬作用中 起调理作用¨ 。 １材料与方法 ＯＭＰ型是由主要ＯＭＰｓ及其差异决定的。 １．１菌株与培养基 收稿日期：２０１０—１０－０９ 基金项目：山东省农业科学院２００７年青年基金支持项目。 作者简介：骆廷波（１９７３一），男，副研究员，现从事预防兽医学研究及新兽药研制工作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｕｏｙａｎｂｏｓａａｓ＠１６３．ｃｏｍ ＋通讯作者 ｌ０４ 山东农业科学 ２０１１年 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌１—１２个血清型 由本实验室分离、保存。细菌培养用ＬＢ液体培 养基。 １．２试剂 ｌ０℃、３５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｈ，沉淀悬浮于１Ｏ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）缓冲液中，置一２Ｏ℃备 用。 １．３．２ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 按参考文献［４］的方法制 胶，浓缩胶为４．８％，分离胶为１２％。步骤１．３．Ｉ 中所得ＯＭＰ制剂每个样品取ｌ５ ｌ，加１５ ｌ样品 ＯＭＰ分离所用的Ｎ一十二烷酰肌氨酸（Ｎ— Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）和Ｎ一２一羟乙基哌嗪一Ｎ一２一 乙磺酸（ＨＥＰＥＳ）分别为Ｓｉｇｍａ公司和上海伯奥生 物科技有限公司（进口分装）产品；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 所用丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｆｉｓ）分别购 自上海伯奥生物科技有限公司（进口分装）和北 缓冲液，１００℃水浴１０ ｒａｉｎ，加样，恒压１２０ Ｖ电 泳。样品缓冲液为含２０％ＳＤＳ ２ ｍｌ，甘油２ ｍｌ，巯 基乙醇１ ｍｌ和０．１％溴酚蓝０．５ ｍｌ，０．５ ｍｏＶＬ Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ６．８）２ ｍｌ的缓冲液。 京夏斯生物有限公司；甲叉双丙烯酰胺、过硫酸 氨和十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）均购自北京鼎国生物 技术发展中心（Ｓｉｍａ分装）。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ考马 ｇ斯亮蓝染色法除考马斯亮蓝Ｒ２５０为北京鼎国生 凝胶的考马斯亮兰染色液按参考文献［４］的 方法进行。凝胶剥离后置经过滤的０．２５％考马 斯亮兰Ｒ２５０—１０％醋酸一甲醇溶液中于摇床上 过夜，将凝胶浸入前述醋酸一甲醇溶液（脱色液 不含燃料），在缓慢旋转的脱色摇床上脱色，直至 出现所要求的条带为止。 物技术发展中心（Ｓｉｍａ分装）产品外，其余均为 ｇ国产试剂。 １．３试验方法 １．３．１ ＯＭＰ的提取［。］ ２结果与分析 由图１可见，在ＡＰＰ的ｌ２个血清型中，血清 型３、８和９的ＯＭＰ是由分子量ｌ９ ｋｕ的一条带组 ①菌株的扩大培养：将５０％甘油保存的菌种 无菌接种于含ＮＡＤ的ＬＢ液体培养基中（ＮＡＤ的 终浓度达到５ ｇ／ｍ１），于８Ｏ～８５￣／ｍｉｎ的振荡 成（ＯＭＰ一１型），血清型２和４的ＯＭＰ是由分子 量３９ ｋｕ和４３ ｋｕ两条带组成（ＯＭＰ一２型），血 清型ｌ２的ＯＭＰ是由分子量ｌ９、４１和４３ ｋｕ三条 培养箱中３７℃培养２４ ｈ以上，直至ＬＢ液体培养 基变得浑浊。 ＠ＯＭＰ的提取：将ｌ２个血清型ＡＰＰ菌液于 ４℃、５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，沉淀悬浮于１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）６ ｍｌ中，４２０ Ｗ输出功 带组成（ＯＭＰ一３型），血清型１的ＯＭＰ是由分子 量１９、３９、４ｌ、４３ ｋｕ四条带组成（ＯＭＰ一４型），血 清型１０和１１的ＯＭＰ是由分子量ｌ９、３９、４ｌ、４３、 ５Ｏ ｋｕ五条带组成（ＯＭＰ一５型），血清型５、６和７ 的ＯＭＰ是由分子量ｌ９、３９、４１、４３、５０、９０ ｋｕ六条 带组成（ＯＭＰ一６型）。 率裂解３０ ｍｉｎ，裂解物于４℃、７ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心ｌ０ ｍｉｎ，收集上清，加入约８倍体积２％的Ｓａｒｋｏｓｙｌ（Ｎ 一十二烷基肌氨酸钠），室温作用２０ ｍｉｎ后，于 Ｍ：低分子量标准蛋白，左边所示数字为标准蛋白的分子量； １～１２：ＡＰＰ １～１２种血清型的外膜蛋白。 图１ ＡＰＰ ｌ２种血清型ＯＭＰ聚丙烯酰胺凝胶电泳图 第３期 ．。． 骆延波等：猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白型的研究 １０５ 的方法，改进后将该方法用于制备ＡＰＰ的ＯＭＰ， 试验结果表明该方法操作简单、快速，对试剂、仪 ３．１ 由试验结果可以看出，猪胸膜肺炎放线杆菌 的ＯＭＰ条带位于１４～９７ ｋｕ之间，１２个血清型的 猪胸膜肺炎放线杆菌共出现了６种ＯＭＰ型，其 中，不同血清型的菌株可以有相同的ＯＭＰ型。目 前，对于ＯＭＰ型的划分尚无统一标准。在此试验 中，以ＯＭＰ条带的多少进行分型，并不影响猪胸 膜肺炎放线杆菌分离株遗传相关性的研究，即可 以客观地反映猪胸膜肺炎放线杆菌分离株遗传相 关性，而传统的血清型则不能反映这一特性。 ３．２近几年来，研究发现，ＯＭＰｓ是猪胸膜肺炎 放线杆菌的一个重要的毒力因子，其本身涉及猪 器设备要求低，能满足实验室试验研究的需要。 但是，由于该方法提取的ＯＭＰ浓度较低，不适用 于大量生产，如何改进制备方法以适用于生产的 需要还有待于进一步研究。另外，所提取各血清 型的ＯＭＰ浓度差异较大，可能是由于液体培养的 各血清型ＡＰＰ浓度不同所致。 ． ．． ． ．． 丐ｘ ［１］Ｆｕｒｅｓｚ Ｓ Ｅ，Ｍａｌｌａｒｄ Ｂ Ａ，Ｂｏｓｓ￣Ｊ Ｔ，ｅｔ ａｌ・Ａｎｉｔｂｏｄｙ—ａｌｌｄ ｄｉｔｃｅｌ ｌ －ｍｅａ —ｉｆｅｃｅｄ ： Ｉ ．，１９９７，６５（２）：３５８—３６５． 胸膜肺炎放线杆菌病的致病机理及免疫机理。诸 ［ ］Ｔｈｗ豳Ｒ Ｎ，Ｋａｄｉｓ曼 ｍｍｔｉｌｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｄ 珊 ｐｌｅｕ 多试验表明，提纯的外膜蛋白和通过基因工程表达的外膜蛋白具有良好的免疫原性和保护作用。 ： ：： １９９１，５９（２）：５４４—５４９． ： 。～ ｅｎ ｌ：＝ Ｏ１．０２￣１１０７不 型 孽篓 问 同的。 ，墨垄 ：可 以产生交叉保护作用，这为 亚单位疫苗研俐Ｒ－ａ－！ ＯＭＰ 寡离 ； 喜 ４６ 。 ．． ， ： ’ 提供了理论基础。本试验为今后研制猪胸膜肺炎 ［４］Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ Ｆ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ－－ａ ｌａ Ｍ ・ｃ。 ｎｇ Ｈ ｈｂ。 吖 放线杆菌ｏＭＰ亚单位疫苗奠定了基础。 ３．３参照高菘等（１９９７） 提取鸡大肠杆菌ＯＭＰ （上接第９６页） 表１ 除草剂对玉米田问不同杂草的防除效果 ３讨论与结论 耕杰除草谱广，除草效果好，对玉米田主要杂 草的防效优于对照药剂，对部分杂草的防效可达 １００％。对于自生麦苗的防除效果不如对照药剂， 一自行恢复，对其后期生长无明显影响。但在应用 中尽量避免药液喷在玉米叶片上。 试验结果表明，５５％耕杰悬浮剂在防除玉米 田间杂草中具有较好的应用价值，可以在生产上 推广应用。但应注意以下问题：一是要注意施用 时期，应在玉米３叶期用药，用药过早会对玉米产 方面可能由于田间遗留麦穗的分布不均，自生 麦苗生长不均造成，另一方面也可能此类药剂本 身对小麦的作用小。 生药害，过迟会影响除草效果。二是喷药要均匀 周到，不能漏喷、重喷，使用浓度不能过高，以免加 耕杰使用不当对玉米有轻微药害，但玉米可 重药害的产生。