一、XX-…辛酸一硫酸鞍法
【原理】
在酸性条件下（pH=
4.5），非igG的蛋白成分（包括白蛋白，部分lg）,能被辛酸等短链脂肪 酸沉 淀，上清中剩余的蛋白主要为igG,再用硫酸鞍沉淀上清，即可获得纯度较高的硫酸鞍法比硫酸钱法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】
1、60mM的醋酸缓冲液（pH
4.0） 200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，力口 ddH 20 至 200ml，调 pH 为 4.04. 10.2mM乙酸
49.2ml，折合566卩的冰乙酸。 0.2M醋酸缓冲液母液60ml： O 20.2M乙酸钠 10.8ml （ 0.2M乙酸钠：
2.72g三水合乙酸钠（MW
IgG。辛酸一136.08） O 溶解于 100mlddH 20XX） 2、10*PBS( 0.1M,pH
7.4)500ml 取 0.2M PB 母液 250ml 加水定容到 500ml,加入 45gNaCI (使 NaCI终浓度为9%)，此时pH约为
7.35，调 pH 至 74
0.2M PB 母液 250ml : 0.2M Na 2HPO
4202.5ml (折合 14.5gNa 2HPO 4 12H 20) 0.2M NaH 2PO
447.5ml (折合 1.482gNaH
2PO 4 2H 20)
1M Tris——Cl (pH
9.0） 100ml 称取
12.1 IgTris ----- Base （MW
121.1），加水至98ml，用HCI调pH至 90
【步骤】
1、 腹水4C, 12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。 2、 腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用 4倍体积的60mM 醋酸缓冲液（pH
4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至 4.5 （一般pH刚好在 4.5左右，可不再调）
3、 逐滴加入辛酸（终浓度为25 〃l/m稀释腹水），待溶解后再加入另一滴， 室温搅拌30min，然后4C静置2h以上，使其充分沉淀。注意：
缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下 来。 4、 12000r/min , 4C, 30min，收集上清。
0
5、 上清液经普通滤纸过滤1次，加入体积的10*PBS （ O.IMpH
7.4）用 1MNaOH 调至 7.4,冰浴至4C。
6、 根据每ml上述混合液加
0.277g固体硫酸钱（0C条件下，45%饱和硫酸钱为
0.291 g/ml），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸镀，不可一次全部加入，而以 小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高。缓慢加入时为了避 免局部的浓度一下子很高，因为硫酸鞍不同的浓度是沉淀不同的蛋白为主，这样就 可能将不想沉淀的蛋白沉淀下来。冰浴条件是为了保证蛋白的活 性，因为硫酸鞍加 入到辛酸溶液后会产热。
7、硫酸鞍全加入后，再搅拌10-30min,使溶液完全平衡，然后就可以进行离 心。一般采取4C搅拌30min后，继续静置至少60min （—般过夜）。再 13000r/min , 4C离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。 但如果进行下面的亲和层析，可直接将沉淀溶解于
1.5ml结合缓冲液中。 二、亲和层析
[HiTrap Protein AG HP 1ml （Amersham Bioscienee 特性】
柱床体积：1 ml 柱子大小： 0.7* 2.5cm
耐受压： 0.3mPa
最大流速：4ml/inin 建议流速：Iml/min
【protein G】
G组链球菌的表面蛋白，属于III型Fc受体，能以非免疫机制的方式结合IgG Fc 区域。protein G 和 IgG 在 pH
7.0时有很强的结合能力，而其结合产物的洗脱一般在
pH
2.5-3是进行。由于IgG对段敏感，会破坏其生物学活性，故一般在收集管 种 种加入 60-200 卩的 1MTris-HCI (pH
9.0),—般用100卩l/m洗脱液，这样纯化的IgG最终会中和成中性。注 JA 音：
经pH洗脫后在收集管内欲置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至 尖 重要。
小鼠IgG单克隆抗体溶液在280nm时。 1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。
【缓冲液准备】
1、 结合缓冲液：20mM sodium phosphate。pH 7.0定容至1000ml 称取
7.6024g Na 3PO 4 2H 20( MW
380.12)，定容置 1000ml，调 pH 至 70
2、 洗脱缓冲液： 0.1M Glycine-HC I pH 2.71000ml 称取
7.507gGlycine (MW 75.07）、定容至 1000ml，调 pH 至 2.7・
【样品准备】
样品最好用结合缓冲液稀释，上柱前样品过滤（ 0.22卩0滤膜）或离心。
【操作步骤】
1 '在收集管中加入100 □的1MTris-HCI （pH 9.0），用于收集1 ml的洗脫液。
2、 将注射器或泵管充满结合缓冲液。移去柱子上接口的塞子，用适配的接头 子将其连接到注射器或者泵管，一 “滴对滴“的方式充满柱子后方可以连接，避 免空
气进入主子。
3、 移去柱子下接口的xx,扭断即可。
4 '用10ml （ 10个柱床体积）结合缓冲液洗柱子，流速为1ml/min 5、 上样：
用2ml上样环上样。
6、 用5-10ml （5-10个柱床体积）结合缓冲液冲洗柱子，直到流出液中没有物质。
7、 用2-5ml （ 5-10个柱床体积）洗脱液进行洗脫。
&纯化产物可以利用Hi Trap Desalting或PD-10柱交换缓冲液。 9、纯化结束后'用20%乙醇保存柱子，防止微生物的生长。
杂
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