摘要
胆碱单加氧酶（CMO）是植物体内胆碱合成甜菜碱过程中的关键酶。甜菜碱是一种非毒性的渗透调节剂，在植物耐盐中起着重要的作用。CMO基因受盐诱导表达，随着环境中盐浓度的提高，其基因表达量增加，CMO基因的诱导表达与其启动子（pC：-267～+1 bp）有关。AtMYB2转录因子是一个受ABA和脱水诱导表达的MYB家族蛋白，它能与-CTAACCA-位点结合，促进下游基因的表达。pC序列上含有一个AtMYB2转录因子的识别位点。本文对AtMYB2转录因子和CMO基因启动子之间的相互作用进行研究，从而分析CMO基因的转录调控机制。
本实验克隆了拟南芥的AtMYB2基因，并将该基因转入已含有pC的烟草中，对转基因烟草的GUS活性进行了组织化学染色及荧光定量分析分析，主要结果如下：
1、用RT-PCR技术获得了拟南芥AtMYB2基因编码区，该编码区长822bp，
编码一个由273个氨基酸组成的多肽。将获得的AtMYB2基因构建克隆载体pUC19-AtMYB2，冻融法导入大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到E.Coli- pUC19- AtMYB2。
2、构建植物表达载体pBI121-AtMYB2，导入根癌农杆菌（Agrobacterium
tumefaciens）LBA4404，获得工程菌LBA4404- pBI121-AtMYB2。 3、采用农杆菌介导的叶盘转化法将AtMYB2基因导入转pC烟草，获得具有卡那霉素抗性的转双价基因烟草，PCR检测获得阳性植株。RT-PCR检测表明，AtMYB2基因已在转基因烟草中表达，GUS组织化学分析和GUS荧光定量分析表明，转基因烟草的GUS含量显著增高，说明AtMYB2转录因子能够与CMO基因启动子作用，增强该启动子的功能。
关键词：拟南芥；AtMYB2；转录因子；CMO基因启动子；GUS分析
Abstract
Choline monooxygenase (CMO) is the key enzyme for betaine synthesis. Betaine is a non-toxic osmopretectant and plays an important role in plant salt-tolerance. CMO expression is induced by salinity and the amount increases with the increasing of salt concentration. The specific expression of CMO gene is related to its promoter (pC：-267～+1 bp). AtMYB2 is a member of MYB transcription factor famliy, which is induced by ABA and dehydration. It can bind to the motif, –TGGTTAG- (the complementary sequence is -CTAACCA-), and enhance the expression of the downstream genes. CMO promoter contains a AtMYB2 recognition site. In this paper, we will study the interaction of AtMYB2 transcription factor with pC and analyze the regulation mechanism of CMO transcription.
In this study, AtMYB2 gene was cloned from Arabidopsis thaliana and transferred into tobacco(C5A) containing pC. The exogenous gene expression and GUS activity were analyzed in AtMYB2 transgenics plants. The main results are as follows:
1.
AtMYB2 gene was obtained through RT-PCR, including a 822bp ORF encoding a 273-amino-acid polypeptide. The cloning vector, pUC19-AtMYB2, was constructed and transferred into competent cell DH5α by the method of freeze and thaw. E.Coli- pUC19- AtMYB2 was obtained. 2. The plant expression vector, pBI121- AtMYB2, was constructed and
transferred into Agrobacterium tumefaciens LBA4404. LBA4404- pBI121- AtMYB2 was obtained. 3.
AtMYB2 gene was transferred into C5A tobacco via Agrobacturium-mediated leaf disk transformation method. PCR analysis showed that kanamycin-resistant AtMYB2 transgenic tobacco was obtained. RT-PCR detection showed that gene has expressed in transgenic tobacco. GUS histochemical staining and fluorescence quantitative analyses in the transgenic tobacco leaves showed that the GUS activity in transgenic tobacco is much higher than that in control tobacco. It suggests that AtMYB2 transcription factor can interact with pC promoter, and enhance the expression of its downstream gene.
Key words: Arabidopsis thaliana; AtMYB2; transcription factor; CMO gene
promoter; GUS GUS analysis
目 录
第一章 文献综述······························································································································1 1 植物MYB2转录因子···················································································································1 1.1 植物MYB2转录因子的结构特点·························································································1 1.2 MYB2转录因子的识别位点··································································································3 1.3 植物MYB2转录因子的进化································································································4 1.4 植物MYB2转录因子的功能································································································5 2 植物转录因子功能的研究方法····································································································7 2.1 瞬间表达分析方法·················································································································7 2.2 基因功能突变或转基因植物功能分析方法··········································································8 2.3 生物信息学方法·····················································································································8 3 本研究的目的和意义····················································································································9 第二章 ATMYB2基因克隆及植物表达载体构建········································································10 1. 实验材料····································································································································10 1.1 植物材料·······························································································································10 1.2 试剂······································································································································10 1.3 主要仪器设备·······················································································································10 2. 实验方法····································································································································10 2.1 拟南芥总RNA的提取·········································································································10 2.2 ATMYB2基因的获得············································································································11 2.3 ATMYB2基因的克隆············································································································13 2.4 ATMYB2基因表达载体的构建····························································································15 3 结果与分析·································································································································16 3.1 拟南芥总RNA的提取·········································································································16 3.2 ATMYB2基因的获得············································································································17 3.3 ATMYB2基因的克隆············································································································18 3.4 ATMYB2植物表达载体的构建····························································································20 4 小结·············································································································································23 第三章 工程菌的构建及烟草转化································································································24 1 实验材料·····································································································································24 1.1 植物材料·······························································································································24 1.2 菌种······································································································································24 1.3 试剂······································································································································24 1.4 主要仪器设备·······················································································································24 2 实验方法·····································································································································24
2.1 植物表达载体转化根癌农杆菌····························································································24 2.2 根癌农杆菌介导转化烟草及抗性芽的筛选········································································25 2.3 转基因植株的PCR检测······································································································26 2.4 转基因植株的RT-PCR检测································································································27 2.5 转基因植株的GUS组织化学染色检测··············································································27 2.6 转基因植株的GUS荧光定量分析······················································································28 3 结果与分析·································································································································30 3.1 冻融法转化农杆菌及检测··································································································30 3.2 农杆菌LBA4404-PBI121-ATMYB2转化烟草········································································30 3.3 转基因植株的PCR检测······································································································31 3.4 转基因植物的RT-PCR检测································································································32 3.5 转基因植株的GUS组织化学染色检测···············································································33 3.6 转基因植株的GUS荧光定量分析·······················································································35 4 讨论·············································································································································35 5 小结·············································································································································36 参考文献·········································································································································37 附 录·········································································································································41 致 谢·········································································································································46
第一章 文献综述
植物在长期进化过程中，为了适应和抵抗各种生物和非生物的胁迫，自身形成了多种机制和复杂的信号网络，使它们能够迅速地感知胁迫，主动地调控耐胁迫反应。基因表达的转录调控在其响应胁迫的过程中起着非常重要的作用，而转录因子是植物中最重要的一类调节基因。
转录因子(transcription factor ，TF)也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用并对转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白[1]。转录因子具有序列特异位点的结合活性或含有同已知DNA结合结构域相同特征的蛋白质，因而能保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达，它通过靶位点上基元，调节靶基因的转录速度。植物许多基因的表达都受到特定的转录因子与特定的顺式作用元件相互作用的调控。自1987年Paz-Ares首次报道了玉米转录因子的克隆以来，研究者们相继从高等植物中分离出了调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及生长发育等相关基因表达的转录因子已达数百种[2]。典型的转录因子一般具有4个功能区：DNA 结合区、转录调控区、核定位信号区和寡聚化位点。转录因子通过这些功能区域与顺式元件相互作用或者与其他转录因子的功能区域相互作用来调控基因的表达。
1 植物MYB2转录因子
1982年Klempnauer[3]等在禽成髓细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus)中鉴定出一个能直接导致急性成髓细胞白血病( acute myeloblasticleukemia)的癌基因,称为v-myb ,不久发现在正常动物细胞中也存在相应的原癌基因c-myb,随后研究结果表明v-MYB、c-MYB蛋白都定位在细胞核中,与核基质和染色质紧密相连，而且都具有DNA结合活性和转录调节功能。玉米的cl基因所编码的蛋白是第一个从植物中发现的MYB转录因子[4]，后来研究发现，在拟南芥和玉米中都存在着大量的MYB转录因子，它们在转录调节中起着多方面的重要作用。MYB转录因子是植物转录因子家族中最大的家族之一，有着广泛的生理功能，几乎参与植物发育和代谢的各个方面。以植物MYB2转录因子为例，它是MYB大家族中的一个小的亚族，不同植物的MYB2基因有着不同的生物学功能，但它们都是在转录水平上调控植物各个阶段的生长发育。
1.1 植物MYB2转录因子的结构特点
MYB家族有高度保守的结合域----MYB结构域，每个结构域约含有50-53个氨基酸残基，形成螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)的构型（图1-1）；每个结构域中有3个保守的色氨酸残基，间隔为18-19个氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维
1
持螺旋-转角-螺旋的构型起着非常重要的作用[5,6]。根据所含MYB结构域的数量，植物中的MYB类转录因子可分为单一MYB结构域蛋白（single-MYB），2个串联MYB结构域蛋白（R2R3-MYB）和3个串联MYB结构域蛋白（R1R2R3-MYB）三个亚类。其中数量庞大、功能多样的是R2R3-MYB蛋白，仅在拟南芥中就有120多种，估计在其它高等植物中也会有相应的甚至更大数量的R2R3-MYB转录因子。
图1-1 小鼠c-MYB蛋白的R3结构域：螺旋-转角-螺旋构型[6] Fig.1-1 The c-MYB protein’s R3 structural domain of mouse: helix-turn-helix
MYB2转录因子含有2个串联MYB结构域（图1-2），属于R2R3-MYB类转录因子。比较12种植物的MYB2蛋白的氨基酸序列，发现MYB2的两个串联MYB结构域中氨基酸序列比较保守，R2中含有3个保守的色氨酸残基，分别间隔19个氨基酸，R3中只含有后2个保守的色氨酸残基，间隔18个氨基酸，而第一个色氨酸残基被异亮氨酸或苯丙氨酸所取代（图1-3）。这些保守的色氨酸残基构成了MYB2蛋白的疏水核心，MYB2蛋白借助此结构插入靶DNA分子大沟与目的基因结合。
图1-2 AtMYB2蛋白的结构简图[7]
Fig.1-2 Structure diagram of AtMYB2 protein
AtMYB2 基因的cDNA全长1138 bp，其中83~904碱基是它的CDS区，共编码273个氨基酸，图中R2和R3表示AtMYB2蛋白有两个MYB结构域，TAD表示它的转录激活区域。
2
图1-3 12种植物MYB2蛋白的保守氨基酸序列比较图
Fig.1-3 Compare with 12 kinds of plant MYB2 protein’s conserved amino acid sequence 颜色一致的地方表示氨基酸序列相同，黑色方框围起的氨基酸序列就是保守的色氨酸残基，其中在R3结构域中，第一个色氨酸残基被异亮氨酸或苯丙氨酸所取代。12种植物MYB2蛋白的氨基酸序列均是来自于Genebank。
研究表明，每一重复子的C-端螺旋是MYB蛋白结合DNA的识别螺旋，其中R3的识别螺旋特异性地与其识别序列的核心结合，而R2的识别螺旋与核甘酸的结合专一性较差[8]。此外，大多数转录因子在C-端与DNA结合域之间都具有一个富含酸性氨基酸的转录激活功能域。Takeshi urao 等通过在拟南芥叶片原生质体中进行瞬时表达实验，分析AtMYB2 基因被干旱诱导后转录激活的活性。AtMYB2转录因子通过序列特异性方式结合到MYB的识别位点上，转录激活报告基因
（MBSx5::GUS，MBS 位点包含一段TAACTG序列）。对AtMYB2 的C-端区域基因删除后，降低了报告基因的转录激活，进一步实验证明AtMYB2 的C-端酸性区域包含了其转录激活足够的氨基酸序列。结果表明，AtMYB2蛋白作为一个转录激活子，它的C-端酸性区域是其行使转录激活功能的重要部位[9]。 1.2 MYB2转录因子的识别位点
转录因子只有与顺式作用元件上的识别位点相结合，才能行使它的生物学功能，通过凝胶阻滞分析，定点突变等常规的实验方法，科学家已经确定了一些MYB2
3
转录因子的的识别序列。
Iwasaki T等对拟南芥的一个脱水响应基因rd22的研究发现，rd22基因启动子中一段67bp的DNA序列上有一个AtMYB2转录因子的识别位点TGGTTAG(其互补序列是CTAACCA) [10]。Hoeren等通过对低氧诱导下，拟南芥的AtMYB2转录因子与ADH1（乙醇脱氢酶）基因启动子的相互作用的研究，证明AtMYB2在ADH1基因启动子上的识别位点是MBS-2 box上的一个GT-基序 (5′-TGGTTT- 3′)，进一步的实验表明，GT-基序中的碱基序列-AAC-是AtMYB2转录因子识别ADH1基因启动子的核心序列[11]。Wang等在研究棉花GaMYB2蛋白在表皮毛生长中的作用时，使用PLACE软件分析找到了GaMYB2的结合位点（-CAGTTG-），进而通过定点突变实验，确定了GaMYB2的作用位点[12]。 1.3 植物MYB2转录因子的进化
1996年，Lipsick提出了一个MYB基因的进化模型，由于后来又在植物中发现了R1R2R3-MYB基因，Jin和Martin对此模型进行了适当的补充。该模型认为大约在10亿年以前产生了MYB结构域，MYB区的复制导致了含有多个不完全重复MYB区的蛋白(R1R2R3-MYB蛋白) 的产生，接下来的整个基因的扩增（在动物身上扩增比较有限）产生了数目繁多的MYB蛋白，因为R1的丢失，从而产生了R2R3-MYB蛋白[5,13]。
Chen Yanhui等通过拟南芥中的MYB基因家族与水稻的MYB基因家族进行系统发生学的比较，认为MYB基因家族在从单子叶向双子叶植物进化过程中经历了一个快速的进化扩张过程。MYB家族其它基因比R2R3-MYB基因更加原始，或者说是进化的更快。因此，MYB超基因家族可以作为很好的完整的体系，用来研究高等植物中复杂的基因家族的进化[14]。MYB2在不同物种中的进化如图1-4所示，从图中可以看出，2种裸子植物聚在一起，6种单子叶植物聚在一起，拟南芥、巨桉、苹果等双子叶植物与裸子植物、单子叶植物亲缘关系较远，这与传统分类完全相同，但陆地棉却聚到了单子叶植物群中，这与传统分类相比出现了差异。
4
图1-4 MYB2在不同物种中的进化 Fig.1-4 MYB2’s evolution in different species
Kamiya等通过研究拟南芥20个生态型的AtMYB2基因的2.2kb区域的DNA多样性，发现该区域核酸多样性系数为0.0027，低于拟南芥其他基因。AtMYB2的MYB结构域核酸多样性系数为0.0036，高于non-MYB区（0.0013）。通过HAK检测，比较这20个拟南芥AtMYB2基因多样性比率和分歧度，发现两者差异性比较大。低的多样性和高的分歧度主要出现在基因的non-MYB区，而non-MYB结构区，不同于一般的突变学说，AtMYB2基因的这种多样性和分歧度主要是由强烈的纯化选汰（Strong purifying selection）和自适应过程（adaptive process）两个方面的结果导致的[15]。
1.4 植物MYB2转录因子的功能
植物MYB转录因子有广泛的生理功能，几乎参与植物发育和代谢的各个方面。single- MYB蛋白，如拟南芥的LHY、CCAI、CPC和RTBP1，水稻的RTBP21、玉米的IBP21等，是一类重要的端粒结合蛋白，在维持染色体结构的完整性和调节基因转录上起重要作用[16]。含有3个MYB结构域的蛋白，如烟草中的R1R2R3-MYB蛋白在细胞分裂的G2/M期发挥重要的调节作用，调控cycle B基因和许多在G2/M期表达的基因[17]。R2R3- MYB成员是植物中数目最多的一类MYB蛋白，MYB2转录因子属于R2R3-MYB蛋白，它们参与应答激素刺激、环境胁迫，参与次生代谢的调节，还参与控制细胞的分化等。 1.4.1在植物抗胁迫中的作用
5
影响植物生长发育的主要环境因素有高盐，干旱，低温，缺氧，激素等，植物通过转录因子与其相应的顺式作用元件相互作用，对外界信号产生响应,调控基因表达，来抵御外界的不利因素。拟南芥中的AtMYB2基因是第一个被发现的受ABA和脱水诱导表达的R2R3-MYB蛋白。AtMYB2蛋白与bHLH
（basic-helix-Loop-helix ,碱性-螺旋-环-螺旋）类蛋白RdBP1相互作用：协同调节rd22基因（response to dessication ,脱水响应基因）的表达[18]。还有研究发现，AtMYB2是一个重要的参与缺氧反应调控的转录调控因子，它结合在一些特定的序列上如Myb 结合位点（ MBS1, MBS2）并诱导这些缺氧基因表达[11]。 1.4.2 控制植物细胞的形态和模式建成
植物MYB转录因子另一个主要功能是控制细胞的形态和模式建成（pattern formation）。
巨桉（Eucalyptus grandis）中的EgMYB2，也是R2R3-MYB转录因子家族亚族的一员，从桉树木质部形成阶段的基因文库中克隆出来。EgMYB2在巨桉的连锁图谱映射一个唯一的位点，与木质素含量的数量性状位点共存。EgMYB2蛋白重组体能够与两个木质素合成基因（CCR和CAD）的启动子结合，这两个启动子包含有MYB2的结合位点，能在瞬时和稳定表达实验中调控CCR和CAD基因的转录。与野生烟草转相比，转基因烟草过表达EgMYB2显示出表型变化，次生细胞壁明显变厚，木质素分布也有变化。木质素合成酶转录本的丰度不同程度上增加，并且苯丙素基因（phenylpropanoid genes）核心没有被影响。结果说明，EgMYB2协同调控木质素的合成和次生细胞壁的形成属于一个独立的途径[19]。
Wang S 等在研究棉花纤维基因控制时，发现棉花GaMYB2蛋白在表皮毛的生长中起重要调控作用。棉花纤维基因的启动子RDL1序列中含有可被MYB2识别的基序，GaMYB2蛋白与其结合，能够进一步驱动棉花纤维基因的表达。实验表明，棉花GaMYB2蛋白/纤维因子1，在酵母和植物中都能转录激活RDL1启动子。通过实时定量PCR和原位杂交分析表明，GaMYB2在棉花纤维早期生长过程中显著表达。转染进入拟南芥后，GL1::GaMYB2能够补偿GL1（拟南芥的一个调控表皮毛生长的MYB转录因子）基因突变体的表皮毛的形成。另外，35S::GaMYB2也能诱导种子表皮毛的产生。对GL1基因和GaMYB2基因的第一个内含子进一步研究发现，它在表皮毛中有增强子的功能，在非表皮细胞中有阻遏子的功能。破坏GaMYB2基因和GL1基因的第一个内含子中的MYB基序，将会影响表皮毛的生成。这些结果表明，棉花和拟南芥使用相似的转录因子调控表皮毛生成，GaMYB2可能是棉花纤维生长过程中关键的调节因子[12]。
Leech MJ等从苔藓丝状体组织的cDNA文库中克隆得到3个含有MYB蛋白结合
6
区域的cDNA，这三个cDNA编码两类不同的MYB蛋白——Pp1和Pp2。这两个蛋白的c-端酸性氨基酸构成α螺旋结构，说明他们和其他myb基因一样，编码的蛋白有转录激活功能。对发育中的小立碗藓（Physcomitrella patens）在转录水平的分析发现，Pp1和Pp2转录的最高水平发生在野生型丝状体组织中，同时其有丝分裂指数也达到最大值。随着野生型组织的生长，两基因的表达量开始下降。两基因在突变的小立碗藓中表达水平异常，也导致其形态学上的变化，尤其是丝状体生长率极大的降低。最终的实验数据表明，在小立碗藓正常的配子形成的细胞生长过程中，Pp1和Pp2两个基因的表达是必不可少的[20]。
除此之外，植物MYB转录因子还有一些其他的生物学功能，例如：调控植物类黄酮代谢，类黄酮是苯丙烷类代谢途径中的一个重要分支，主要与植物色素合成相关[21~23]，控制细胞凋亡[24]，调节植物的抗病性[25]等。虽然植物MYB转录因子的生物学功能多种多样，但是MYB转录因子在行使其生理功能时，不是单独起作用的。实验表明，一种钙调蛋白GmCaM4能够与AtMYB2转录因子结合，增强拟南芥的抗盐能力。拟南芥中过表达的GmCaM4蛋白可以提高AtMYB2转录因子的转录效率，同时提高脯氨酸合成酶的含量，进而促进盐胁迫下植物体内脯氨酸的积累[7]；在ABA和脱水诱导下，拟南芥的AtMYB2蛋白和AtMYC蛋白共同作用，rd22基因被调控，表达量最高，而在突变体中，AtMYB2蛋白单独调控rd22基因，其表达量并不十分明显[18]。
2 植物转录因子功能的研究方法
随着植物功能基因研究的深入，用来研究植物基因功能的方法也越来越多，目前在传统的转基因植物分析的基础上，用来研究植物转录因子功能的方法主要有以下几种：瞬间表达分析方法、基因功能突变分析方法等。另外，近年来发展起来的RNA干涉 (RNAi) 以及生物信息学方法等，已经被证明是研究植物转录因子功能非常有效的方法。 2.1 瞬间表达分析方法
通过植物转录因子瞬间表达分析可以得出转录因子的DNA结合特征以及转录活性（包括转录激活和转录抑制）等各种信息[26]。目前用得比较多的瞬间表达分析方法有酵母单杂交和酵母双杂交分析法。
酵母双杂交体系是一种以酵母的遗传学分析为基础、研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验体系。该体系的建立是根据以下原理：酵母转录因子（主要是Gal4p）的DNA结合功能区（BD）和转录激活功能区（AD）在物理结构和功能上均分别处于相对独立的结构域中［27］，因此，在酵母中表达的两个相互作用的蛋白
7
质分别与转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域相融合，形成两个杂交体，即BD-X和AD-Y。单独的BD-X或AD-Y都不能启动下游报告基因的转录，而BD-X与AD-Y相互作用可以重新形成有功能的转录因子，从而进一步激活含有BD结合位点的启动子下游报告基因的表达［28~30］。如果在表达性基因文库中存在AD-Y，则用BD-X可直接从该文库中筛选出与之相互作用的AD-Y基因序列。
酵母单杂交体系是从酵母双杂交体系发展而来的。酵母单杂交体系中，省略了在酵母双杂交体系中采用的BD-X蛋白质杂交体
［31］
，而用特异的DNA序列取代
DNA Gal4p结合位点，该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白（BDPX）与Gal4p的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达
［32,33］
。理论上来说，酵母单杂交体系可利用靶DNA序列，捕获具有
与该元件特异结合结构域的蛋白质。该体系不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。 2.2 基因功能突变或转基因植物功能分析方法
植物转录因子基因功能突变包括基因功能的缺失突变和获得性突变两个方面。过去是通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变植株，但这种方法筛选到的突变体数量有限，而且也不一定是研究所需的目标突变体。现代生物技术的发展为生产人工突变体提供了有力的工具，这不仅大大增加了所需突变体的数量，而且可以实现定点突变，从而很容易获得目标突变体。目前实验室中采用的功能缺失突变的研究方法主要有反义抑制[34]、转座子插入突变[35]、T-DNA 插入突变[36]、以及近些年来兴起的RNAi技术[37]等。
植物转录因子基因功能获得性突变主要包括超量表达和诱导表达两种，超量表达是指将转录因子基因全长序列与组成型强启动子融合，转化受体材料，获得目标基因产物过量积累的植株。但该方法得到的目标基因的超量表达往往产生致死效应或者多重效应，从而很难从表型上正确评价目标基因对植株的真实作用[38]，因此具有很大的局限性。而另一些基因诱导表达系统，如基于四环素阻抑物的四环素诱导系统[39]，四环素失活系统[40]，基于脱皮激素受体的杀虫剂诱导系[41~43]，基于AlcR的乙醇诱导系统[44]等等，这些诱导表达系统可以实现基因表达的时间控制，因而可以避免这些局限，为下一步转基因植株的分子检测[45]打下基础，所以诱导表达系统成为基因功能获得性研究中更为有效的一种方法。 2.3 生物信息学方法
目前生物信息学对于转录因子的研究主要是集中在DNA和蛋白质序列上, 其
8
目标是分析研究转录因子序列数据中所含的各种信息，特别是DNA序列中的遗传及调控信息以及蛋白质序列与结构功能的关系等。它把基因组DNA序列信息分析作为源头，进行蛋白质、RNA等的结构模拟和分子设计以及随之而来的药物设计。
以计算机为辅助的生物信息学方法广泛地应用于DNA与蛋白质之间相互作用的研究。它可以完成对基因组中庞大调控序列的分析，进行启动子及转录因子结合部位预测。与传统的实验方法比较，生物信息学方法具有快速可靠的特点。Liu等利用生物信息学方法测定了具有锌指结构的蛋白质与其相应的DNA之间的亲和力，测定结果与实验方法的结果具有很好的一致性[46]。众多结果表明，生物信息学方法可以从大量的非编码区中筛选出转录调控元件，为进一步实验提供指导方向。把生物信息学作为工具，分析已完成的基因组和调节信号，是许多研究群体当前的任务。但是，从生物信息学得出的结论仅仅是对于生物信息的预测, 其结论需要通过实验方法进行验证，只有将以上的各种方法综合运用，才能得出可靠的实验结论。
3 本研究的目的和意义
在干旱、盐碱等逆境条件下，植物体内可以积累大量的甜菜碱。甜菜碱是一种非毒性的小分子渗透调节物质，在具有甜菜碱合成能力的高等植物中，甜菜碱合成后几乎不再被进一步代谢，属于永久性或半永久性渗透调节剂，甜菜碱的积累不但能降低细胞渗透势，增强吸水能力，以维持细胞渗透压[47]，还具有在渗透胁迫条件下稳定生物大分子结构和功能的作用，对改善渗透调节、保护细胞膜具有重要的作用。甚至通过施用外源甜菜碱也可以提高植物抗盐性[48,49]。
甘氨酸甜菜碱是以胆碱为底物经两步酶促反应合成，即：胆碱→甜菜碱醛→甘氨酸甜菜碱[50]，胆碱单加氧酶（CMO）[51]是催化其第一步反应的关键酶，CMO基因的表达受体外盐胁迫的调控。2007年，李秋莉等[52]从盐生植物辽宁碱蓬中分离了CMO基因启动子，并做了序列分析，尹辉等[53]对CMO基因启动子进行了功能研究，CMO基因启动子（pC：-267～+1 bp）是盐诱导启动子，400mmol/L NaCl诱导时，其驱动的GUS活性是未经NaCl诱导时的5倍。pC序列中含有1个AtMYB2转录因子可能的识别位点（-CTAACCT-），AtMYB2转录因子有可能与上述识别位点结合，增强CMO基因启动子的功能，促进其下游基因的表达。
本研究将克隆AtMYB2基因，将其转入已经含有CMO基因启动子的转基因烟草中，对获得的双价转基因烟草进行GUS组织化学染色和荧光定量检测，从而分析AtMYB2转录因子与CMO启动子的相互作用。该研究在转录水平对CMO基因表达调控进行研究，对探讨耐盐基因的表达调控机制具有一定的理论意义；获得有效的转录因子，对提高转基因植物的耐盐性具有一定的实际意义。
9
第二章 AtMYB2基因克隆及植物表达载体构建
植物基因克隆及表达载体构建是植物基因工程研究的重要基础。本实验将分离拟南芥AtMYB2转录因子，构建其植物表达载体。
1. 实验材料
1.1 植物材料
拟南芥（Arabidopsis thaliana）种植于温室内，实验前用250mM NaCl处理10-24h。 1.2 试剂
Trizol试剂盒，PCR片段回收试剂盒、DNA连接试剂盒、限制性内切酶、克隆载体pUC19、感受态大肠杆菌（E.coli）DH5α、DNA Marker为TAKARA（大连）公司产品；植物表达载体pBI121为CLONTECH公司产品；引物合成、测序工作在TAKARA（大连）公司完成；天根公司反转录试剂盒，DEPC为Promaga公司产品，其它试剂为国产分析纯。 1.3 主要仪器设备
HPG—280B 光照培养箱
CA—1301—1 垂直层流洁净工作台 TH—3560 灭菌锅
DHG—9123A 电热恒温鼓风干燥箱 THZ—82B 气浴恒温振荡器 TGL—16 台式高速离心机 Thermo IEC 离心机 DY602S 稳压稳流电泳仪
TRANSILLUMINATOR 2020D 凝胶成像系统 Techne PCR仪 HH—W 三用恒温水箱 WFH—202型 PCR紫外透射仪 DRP—9082型 电热恒温培养箱
2. 实验方法
2.1 拟南芥总RNA的提取
10
本实验采用Trizol法提取拟南芥总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性并与DNA marker比对，粗略计算RNA的浓度，为下一步实验作准备。 2.1.1 Trizol法提总RNA
1) 取250mM NaCl诱导10-24h后的拟南芥新鲜叶片50-100 mg，液氮研磨成
粉。将研磨好的材料迅速转移到1.5ml Tube管中，加入1 ml预冷的Trizol试剂。
2) 将样品用1ml枪头反复吸吹20次，在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白
复合物完全分离
3) 可选步骤：4℃，10,000 g离心10min，取上清。（此步骤对多糖含量高的
组织不能省略）。
4) 每使用1ml Trizol加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振摇15 sec，室温放置
10 min。
5) 4 ℃，10,000 g离心10 min，样品会分层，RNA主要在上层的水相中，水
相的体积大约为所用Trizol的60%，把水相移到新管中。 6) 每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min。
7) 4 ℃，10,000 g离心10 min，去上清，离心前RNA沉淀经常是看不见的，
离心后在管侧和管底形成胶状沉淀，移去上清。
8) 加入1 ml预冷的75% 乙醇，摇匀，洗涤沉淀，于4 ℃，7,500 g离心5 min。 9) 弃去上清液，真空干燥5 min。加入20μl RNase-free水溶解沉淀。 2.1.2 RNA完整性及浓度检测
用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性并确定RNA的浓度。 2.2 AtMYB2基因的获得
根据GenBank中收录的拟南芥AtMYB2基因序列设计引物，利用RT-PCR反应扩增目的基因片段，并将PCR产物纯化，测序。 2.2.1 RT反应
以提取的总RNA为模板，使用天根反转录试剂盒进行反转录。 1) 反转录反应体系：
RNA模板 9.5μl
NTP Mixture 2μl 13.5μl Oligo dT-adapter Primer 2μl
11
2) 将Tube管放入70℃水浴锅，5min；然后冰上冷却2min。 3) 向上述Tube管中添加如下反应液：
5×First-Stand Buffer 4μl 0.1M DTT 1μl RNsin 0.5μl TIANScript M-MLV（200U） 1μl
4) 轻轻用移液器混匀，25℃，10min；42℃，50min；95℃，5min。 5) 加Rnase-free ddH2O将反应得到的cDNA稀释到50μl，-20℃保存备用。 2.2.2 PCR反应
以反转录得到的cDNA为模板，根据GenBank中收录的拟南芥AtMYB2基因序列 设计一对引物，F:-ggGGATCCATGGAAGATTACGAGCGAAT-； R:-ggGAGCTCTTAATTATACGAATACGATGTC-，进行PCR反应。
PCR反应体系如下：
cDNA模板 1μl 10×Ex buffer 5μl TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.25μl dNTP Mixture（各2.5nM） 4μl Primer F(10pM) 2μl Primer R(10pM) 2μl ddH2O 35.75μl Total 50μl
反应条件： 94℃ 1min 94℃ 30sec 72℃ 1min
72℃ 10min
4℃ ∞ 2.2.3产物回收与测序
1) 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
2) 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶（注意尽量切除不含有目的
DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率）。 3) 切碎胶块。
12
56℃ 30sec ×30循环
4) 称量胶块重量，计算胶块体积（胶块体积大约1mg=1μl）。 5) 向胶块中加入3倍胶块体积量的融化液DR-I Buffer。
6) 均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需45℃加热）。此间应
间断震荡混合6-10min，使胶块充分融化。
7) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量1/2体积的DR-IIBuffer，均匀混合。 8) 将试剂盒中的Spin Column安置于Column Tube上。
9) 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液
（如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率）。 10) 将500μl的Rinase A加入Spin Column中，12,000rpm离心30sec，弃滤液。 11) 将700μl的Rinase B加入Spin Column中，12,000rpm离心30sec，弃滤液。 12) 重复操作步骤11。
13) 将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜的中央处加
入25μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置1min(把灭菌水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率)。 14) 12,000rpm离心1min洗脱DNA。 15) 琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。
16) 将纯化后的AtMYB2编码区片段送至TAKARA（大连）公司测序。 2.3 AtMYB2基因的克隆
碱裂解法提取pUC19质粒，对AtMYB2片段、pUC19质粒进行双酶切、连接、转化大肠杆菌，构建克隆载体E.coli- pUC19-AtMYB2。 2.3.1 pUC19质粒制备
1) 摇菌：按1:100比例将大肠杆菌菌接入LB液体培养基（含抗生素Amp
100mg/L），250rpm，于37℃振荡培养过夜。
2) 集菌：将37℃过夜培养的大肠杆菌移至Eppendorf管中，4℃ 12,000rpm
离心1min，集菌3次（1ml/次）。
3) 弃上清，细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡，使细菌沉
淀完全分散。
4) 加入400μl新配置的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混匀内
容物，之后将离心管置于冰上5min（注意：动作要温和）。
5) 加入300μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀10次，之后将离心
管置于冰上20min，4℃ 12,000rpm离心10min，将上清液转移到另一离心管中。
13
6) 取上清，加10μlRnase A，37℃消化1h至过夜。
7) 加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），剧烈振荡5min，4℃，12,000rpm离心
5min。
8) 上清移入另一离心管中，加入冰预冷的0.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，冰
上放置20min；4℃，12,000rpm离心10min。
9) 小心弃去上清，加入500μl 70% 乙醇洗涤DNA沉淀，4℃，12,000rpm离
心10min。
10) 小心弃去上清，倒放置即可，自然风干，用20μl ddH2O溶解。 11) 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，观察并照相。 2.3.2 酶切
分别将AtMYB2编码区片段和克隆载体pUC19用BamHⅠ、SacⅠ双酶切。酶切反应如下：
pUC19(10μg) 70μl AtMYB2 gene（4μg） 24μl 10×K buffer 10μl 10×K buffer 7.5μl
BamHⅠ 9μl BamHⅠ 3.6μl SacⅠ 10μl SacⅠ 4μl ddH2O 101μl ddH2O 45.4μl Total 200μl Total 80μl
酶切反应在37℃下温浴3hr。
2.3.3 连接
回收酶切后的AtMYB2片段和pUC19大片段（方法同2.2.3）。用TAKARA连接试剂盒将回收的AtMYB2片段和pUC19大片段进行连接。
反应条件为：
pUC19 1μl（50ng） AtMYB2 3μl（150ng） SolutionⅠ 4μl 16℃温浴2hr，加Solution III 1μl。 2.3.4 转化
将连接液热击法转化大肠杆菌（E.coli）DH5α。具体操作如下： 1) 取1管大肠杆菌DH5α感受态细胞（含100μl菌液），在冰上融化。
14
2) 将上述连接液全部加入融化的DH5α感受态细胞中，冰上放置30min。 3) 42℃水浴热击45sec，冰上放置2～3min。
4) 加入900μl LB培养基，转移至37℃摇床中170rpm振荡培养1hr。 5) 然后涂布于含有100mg/L Amp的LB平板上，37℃下过夜培养。 2.3.5 检菌
选取3个转化后的菌落，PCR法鉴定阳性克隆。具体操作如下：
准备3个0.5ml Tube，各加入10μlddH2O；用灭菌牙签分别挑取3个单菌落加入Tube中；99℃变性10min；以此为模板，用天根2×Taq PCR Master Mix体系，加入AtMYB2引物F/R，进行PCR反应。
反应如下： 模板 10.5μl
Primer F 1μl Primer R 1μl 2×Master Mix 12.5μl Total 25μl
反应条件：94℃ 3min
94℃ 30sec
56℃ 30sec ×30循环 72℃ 1min 72℃ 5min
4℃ ∞
琼脂糖凝胶电泳检测结果。 2.3.6质粒检测并测序
将PCR检测后的单菌落用牙签挑起，接入LB液体培养基，摇菌，提质粒，提取的质粒进行PCR法和酶切法检测，方法同2.3.5，进一步确认AtMYB2基因已转入pUC19中；质粒送去TaKaRa公司测序。 2.4 AtMYB2基因表达载体的构建 2.4.1 质粒制备
提取质粒pUC19-AtMYB2，pBI121，方法同2.3.1。
15
2.4.2 酶切
分别用BamHⅠ、SacⅠ酶切pUC19-AtMYB2和pBI121。反应体系如下：
pUC19- AtMYB2 (5μg) 5μl pBI121（10μg） 20μl 10×K buffer 5μl 10×K buffer 5μl BamHⅠ 5μl BamHⅠ 6μl SacⅠ 5μl SacⅠ 10μl ddH2O 80μl ddH2O 59μl Total 100μl Total 100μl
酶切反应在37℃下温浴3hr。 2.4.3 连接
方法同2.3.3。 2.4.4 转化
将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，方法同2.3.4。 2.4.5 检菌
将过夜长出的菌落用牙签挑菌，PCR检测获得阳性克隆，方法同2.3.5。 2.4.6 质粒检测
方法同2.3.6。
3 结果与分析
3.1 拟南芥总RNA的提取
Trizol法提取拟南芥总RNA，琼脂糖凝胶电泳呈现了典型的28S、18S、5S三种RNA带型，各条带无明显的拖尾现象（图2-1），与DL200 DNA Marker相比，可以粗略计算所提取的RNA浓度在100ng/μl左右。
16
M 1 2
图2-1拟南芥总RNA
Fig.2-1 Agarose gel electrophoresis of Total RNA
M,DL200 DNA Marker; 1，2,Total RNA
3.2 AtMYB2基因的获得
用引物F和R通过RT-PCR扩增出约830bp的AtMYB2编码区片段（图2-3），经TAKRA公司测序，实验所得目的基因片段与GenBank中收录的拟南AtMYB2 CDS（83~904）基因序列（图2-4中划线处）一致。
M 1
图2-3 AtMYB2基因编码区的电泳图
Fig.2-3 Agarose gel electrophoresis of PCR analysis of AtMYB2 CDS
M, DL2000 DNA Marker; 1，2，3，4，PCR product
17
图2-4 AtMYB2基因编码区 Fig.2-4 AtMYB2 CDS
3.3 AtMYB2基因的克隆
提取pUC19质粒（图2-5），酶切（图2-6），连接，将AtMYB2基因重组至克隆载体pUC19，经PCR鉴定出阳性克隆（图2-7），测序后获得正确的克隆pUC19- AtMYB2。
18
M 1
2-5 pUC19质粒提取电泳图
Fig.2-5 Agarose gel electrophoresis of pUC19
M, DL2000 DNA Marker; 1,pUC19
M 1 2 3 M
图2-6 pUC19质粒和AtMYB2酶切电泳图
Fig.2-6 Agarose gel electrophoresis of AtMYB2 and pUC19 cutted by
restriction enzyme BamHⅠ、SacⅠ.
M, DL2000 DNA Marker; 1, pUC19; 2,cutted pUC191；3,cutted AtMYB2
19
M 1 2 3
图2-7 PCR检测阳性克隆电泳图
Fig.2-7 Agarose gel electrophoresis of PCR analysis of pUC19-AtMYB2
M, DL2000 DNA Marker; 1，2，3，PCR product
3.4 AtMYB2植物表达载体的构建
AtMYB2基因表达载体构建过程见图2-8
pUC19-AtMYB2和pBI121用BamHⅠ、SacⅠ酶切后（图2-9），进行连接、转化大肠杆菌DH5α，经PCR检菌、酶切后筛出正确克隆（图2-10）。AtMYB2植物表达载体pBI121-AtMYB2如图2-11。
20
图2-8 AtMYB2基因表达载体构建流程图
Fig.2-8 Construction diagram of expression vector for AtMYB2
21
M 1 2 3 M
图2-9 pBI121 and pUC19-AtMYB2双酶切电泳图
Fig.2-9 Agarose gel electrophoresis of pBI121 and pUC19-AtMYB2 cutted by
restriction enzyme BamHⅠ、SacⅠ.
M, DL2000 DNA Marker;1，pUC19-AtMYB2；2，cutted pUC19- AtMYB2；3，cuttde pBI121
M1 1 2 3 M2
图2-10 pBI121-AtMYB2的酶切检测和PCR检测电泳图 Fig.2-10 Agarose gel electrophoresis of pBI121-CMO PCR and cutted by
restriction enzyme BamHⅠ、SacⅠ
M1,λ-Hind Ⅲ DNA Marker; 1, pBI121- AtMYB2；2，cutted pBI121- AtMYB2;
3，PCR product；M2,DL2000 DNA Maker
22
图2-11 pBI121-AtMYB2植物表达载体结构图 Fig.2-11 Structure of plant expression vector pBI121-CMO
4 小结
① 利用RT-PCR法，从拟南芥中克隆了AtMYB2基因编码区，编码一个由273个氨基酸构成的多肽。
② 构建了植物表达载体pBI121-AtMYB2，为转化植物、研究其功能奠定了基础。
23
第三章 工程菌的构建及烟草转化
1 实验材料
1.1 植物材料
野生烟草(Nictiana tabacum L.cv.89) ，转pC烟草（C5A）为本实验室保存。 1.2 菌种
根癌农杆菌(Agribecterium tumefaciens)LBA4404为本实验室保存菌种。 1.3 试剂
链霉素、利福平、卡那霉素、头孢霉素等抗生素购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其它试剂均为国产分析纯。 1.4 主要仪器设备
HPG—280B 光照培养箱
CA—1301—1 垂直层流洁净工作台 TH—3560 灭菌锅
DHG—9123A 电热恒温鼓风干燥箱 THZ—82B 气浴恒温振荡器 TGL—16 台式高速离心机 Thermo IEC 离心机 DY602S 稳压稳流电泳仪
TRANSILLUMINATOR 2020D 凝胶成像系统 Techne PCR仪 HH—W 三用恒温水箱 WFH—202型 PCR紫外透射仪 DRP—9082型 电热恒温培养箱 722光栅分光光度计 Themo Labsystems 酶标仪
TwinkleTM LB970T Fluorometer 荧光检测仪
2 实验方法
2.1 植物表达载体转化根癌农杆菌
采用冻融法将表达载体转入根癌农杆菌，构建工程菌。
24
2.1.1 提取质粒pBI121-AtMYB2
方法同2.3.1。
2.1.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备
1) 挑取LBA4404单菌落菌体于含有链霉素（Stre）300mg/L、利福平（Rif）
100mg/L的YEB液体培养基中，28℃，160rpm振荡培养过夜；
2) 取过夜培养的菌体按1:100的比例接种到50ml YEB液体培养基中，28℃，
160rpm振荡培养3~4h至细菌生长对数期OD600=0.5~0.6左右； 3) 4℃，4000rpm离心10min；
4) 沉淀用5ml预冷的TE（pH7.5）洗涤一次， 加2~3ml新鲜的YEB培养基，
重新悬浮，分装（0.2ml/tube）； 5) -70℃保存。 2.1.3 冻融法转化农杆菌
1) 取1管感受态根癌农杆菌（0.2ml）置冰上融化，加入0.5~1μg质粒
（pBI121-AtMYB2），混匀；
2) 依次在冰上、液氮中及37℃水浴中放置5min； 3) 用YEB稀释至1ml，于28℃，160rpm振荡培养2~4h；
4) 取适量菌液涂布于含有链霉素（Stre）300mg/L、利福平（Rif）100mg/L、
卡那霉素（Km）50mg/L的YEB平板培养基上； 5) 28℃培养36h左右长出抗性菌落。 2.1.4 农杆菌的PCR检测
用PCR法检测阳性菌落。具体操作如下：
无菌牙签随机挑取抗性菌落置于含有15μl ddH2O的Eppendorf管中；-20℃放置30min，100℃煮沸5min；重复冻融一次；以此为模板，用天根2×TaqPCR Master Mix体系，引物F/R进行PCR反应，反应体系同第二章2.2.2。 2.2 根癌农杆菌介导转化烟草及抗性芽的筛选
外源基因导入植物基因组采用了根癌农杆菌介导的叶盘转化法。 2.2.1 转化用烟草叶片的预培养
取30~45天苗龄的转C5A基因烟草无菌叶片，剪成1~2cm的小块作为外植体。远轴面向上，近轴面向下置于烟草分化培养基（MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L）
25
上。在光照培养箱内预培养2天，光照强度为3000lx，温度为25℃，每天光照15h。 2.2.2 农杆菌的培养
按1:100的比例吸取根癌农杆菌LBA4404- pBI121- AtMYB2菌液，接种于含Stre 300 mg/L、Rif 100mg/L 、Km 50mg/L的YEB液体培养基中，在28℃下振荡培养过夜。再按1:50的比例接种于不含抗生素的YEB液体培养基中，培养4~6h，当其OD600值达0.5左右时，用于浸染。 2.2.3 浸染
将预培养的烟草叶片于菌液中浸染5min后，用无菌滤纸吸干菌液，远轴面朝上重新放回培养基中，边缘要与培养基贴实，进行共培养，时间约为2天。 2.2.4 抗性芽的筛选及转基因植株在卡那霉素中的生根培养
共培养2天后，当叶片周围长出肉眼可见菌落时转移至含有卡那霉素(Km) 100mg/L、头孢霉素（Cef）500mg/L的分化培养基上筛选培养，大约4~6周才能分化。然后将筛选出的抗性芽接种于附加Km的1/2MS培养基上继代筛选并增殖、生根，待长出5~6片叶时再进行检测。 2.3 转基因植株的PCR检测
选择生长良好的野生烟草和转基因烟草，采用CTAB法[54]提取烟草总DNA，并进行PCR检测。
2.3.1 转基因烟草叶片总DNA的提取
DNA提取方法如下：
1) 0.7ml提取缓冲液65℃预热30min。
2) 取新鲜转基因烟草叶片约0.1g，液氮中迅速研磨成粉末。
3) 将粉末转移至预热的管中，充分混匀，65℃水浴60~90min，其间上下轻
缓混合2~3次。
4) 取出，降至室温后加入等体积氯仿:异戊醇（24:1），上下轻缓混合20min，
10000rpm离心10min。
5) 小心取出上清液（约0.6ml），转入一新的管1.5ml离心管中，加入等体积
酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），上下轻缓混合20min，10000rpm离心10min。 6) 小心取出上清液，加入等体积异丙醇，-20℃放置2min，13000rpm离心
15min。
7) 弃上清，加入1ml 70%乙醇，混合，13000rpm离心15min。
26
8) 弃上清，真空干燥。
9) 加入16μl灭菌双蒸水，轻缓混匀，加入1μl RNase酶，37℃消化1h左右。 10) 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，观察并照相。
（CTAB提取缓冲液：3% CTAB，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA ，1.4mol/L NaC1，2% PVP，1% 巯基乙醇 pH8.0） 2.3.2 PCR检测
以提取总DNA为模板，用天根2×TaqPCR Master Mix体系，引物F/R进行PCR反应，反应体系同第二章2.2.2。 2.4 转基因植株的RT-PCR检测
提取转基因烟草的总RNA，以oligo(dT)15为引物进行转录，再以反转录产物为模板进行RT-PCR分析，方法同第二章2.2.1，2.2.2，检测烟草中转入的AtMYB2基因的转录情况。
2.5 转基因植株的GUS组织化学染色检测
采用组织化学染色定位法中的直接染色法。参照Jefferson（1987）方法[55]，加以改进。 2.5.1试剂：
1) GUS缓冲液：
50mmol/L磷酸氢钠缓冲液（pH7.0） 10mmol/L EDTA
0.1%(v/v) Triton X-100 2mmol/L铁氢化钾 2mmol/L亚铁氢化钾 4℃下保存备用 2) GUS染色液：
用N，N-二甲基甲酰胺溶解X-Gluc粉剂，配成20mmol/L的溶液，-20℃下保存备用。
3) GUS蛋白提取缓冲液：
50mmol/L 磷酸钠（pH7.0） 10mmol/L EDTA
0.1%(v/v) Triton X-100
0.1% Sarcosyl（十二烷基肌氨酸钠）
27
10mmol/L β-巯基乙醇
4) 4-MU（4-甲基伞形酮）：1mmol/L
称取19.82mg 4-MU钠盐，用ddH2O 溶解，定容100ml。4℃，暗处可贮存一个月，贮存中有发生结晶的可能。
5) 反应缓冲液：GUS提取缓冲液中加入1mmol/L 4-MUG（100ml加入
35.23mg），4℃可保存2周。 6) 反应终止液：0.2mol/L Na2CO3
7) 考马斯亮蓝G250溶液：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙醇中，
加100ml磷酸，ddH2O定容1L，过滤后于4℃贮存。 8) BSA溶液：1mg/ml 2.5.2 GUS组织化学分析
1) 用取孔器取PCR检测阳性的转基因植株的叶片置于小离心管中，加入GUS
缓冲液浸没组织块，再加入5%（v/v）用量的GUS染色液，混匀后37℃下，黑暗环境保存16~24h；
2) 将叶片转入70%乙醇溶液中脱色2~3次，直至阴性对照材料呈白色； 3) 肉眼或显微镜下观察，白色背景下的蓝色小点即为GUS表达位点。 2.6 转基因植株的GUS荧光定量分析
筛选GUS染色较深的转基因烟草，对其叶片中的GUS酶活性进行定量分析，GUS活性的荧光检测参照Jefferson（1987）方法[61]，加以改进。
荧光法对GUS活性进行定量检测的原理是：GUS催化4-MUG（4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖醛酸苷）水解为4-MU（4-甲基伞形酮）及β-D-葡糖醛酸。4-MU分子的羟基解离后被365nm的激发光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。具体方法是：用磷酸缓冲液提取可溶性蛋白后，在一个时间点上测定溶液的总荧光量，减去内源荧光量（以CK估算，烟草中可忽略）后，根据标准曲线对4-MU进行定量，然后计算每毫克蛋白、每分钟生成4-MU的量来表示GUS的活力。蛋白浓度根据考马斯亮蓝法测定。 （1）GUS提取
1) 取幼苗第3、4叶片置液氮中研磨成粉。 2) 加入3倍体积的提取缓冲液，制成匀浆。
3) 4000r/min离心10min，收集上清液，于冰箱中保存备用。 （2）GUS提取液蛋白含量测定（Bradford 法）[56]
28
1) 制作标准曲线 配制BSA梯度液：
0.5mg/ml BSA：取100μl 1mg/ml BSA与100μl dH2O混合 0.25mg/ml BSA：取100μl 0.5mg/ml BSA 与100μl dH2O混合 0.125mg/ml BSA：取100μl 0.25mg/ml BSA与100μl dH2O混合 0.0625mg/ml BSA：取100μl 0.125mg/ml BSA与100μl dH2O混合 0.03125mg/ml BSA：取100μl 0.0625mg/ml BSA与100μl dH2O混合 从中取20μl加入200μl考马斯亮蓝G250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm的吸收值，以20μl ddH2O加入200μl考马斯亮蓝G250溶液为空白溶液，吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。
2) 提取液蛋白含量测定：取植物材料GUS提取液20μl，加入200μl考马斯
亮蓝G250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm的吸收值，根据标准曲线计算样品蛋白质含量。
（3）酶反应
1) 取1支Eppendorf离心管加入反应缓冲液1ml，37℃水浴中预热。 2) 取6支Eppendorf离心管，各加入900μl反应终止液，编号。
3) 1ml预热反应缓冲液，加入2~100μl提取缓冲液（具体的用量根据材料情
况而定），混匀，立即取出100μl加入到1号管中，此为反应0时的样品（荧光测定时以此为空白），并开始严格记时。
4) 将反应管放入37℃水浴中进行酶反应，分别于5、15、25、30、45min时
各取100μl反应液，依次加入到2~6号管中，混匀，分别为酶反应5、15、25、30、45min时的样品，供荧光测定用。
（4）荧光测定
1) 制作标准曲线
配制4-MU梯度浓度液：
100μmol/L 4-MU：取100μl 1mmol/L 4-MU与900μl反应终止液混合 10μmol/L 4-MU：取100μl 100μmol/L 4-MU与900μl反应终止液混合 2.5μmol/L 4-MU：取500μl 10μmol/L 4-MU与1500μl反应终止液混合 1.25μmol/L 4-MU：取500μl 2.5μmol/L 4-MU与500μl反应终止液混合 1μmol/L 4-MU：取200μl 10μmol/L 4-MU与1800μl反应终止液混合 0.5μmol/L 4-MU：取500μl 1μmol/L 4-MU与500μl反应终止液混合 0.1μmol/L 4-MU：取100μl 1μmol/L 4-MU与900μl反应终止液混合 0.05μmol/L 4-MU：取100μl 0.5μmol/L 4-MU与900μl反应终止液混合 0.01μmol/L 4-MU：取100μl 0.1μmol/L 4-MU与900μl反应终止液混合
29
在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测各样品的荧光，以反应终止液为空白溶液，绘制标准曲线。
2) 样品荧光测定以1号管为空白，在上述条件下测定2~6号管的荧光强度，
从标准曲线上查出定2~6号管中4-MU的含量。
（5）酶活力计算
1) 以酶反应时间对4-MU含量作图，直线部分的斜率即为酶反应初始阶段的
速度。
2) 酶活力单位定义为：每分钟水解4-MUG生成1pmol或1nmol、1mg、1μg、
1ng 4-MU的酶量为一个单位，根据定义求出各样品的酶活力。
3) GUS基因表达活性以每毫克蛋白的酶活力表示，将样品酶活力除以上述测
得的样品蛋白含量。
3 结果与分析
3.1 冻融法转化农杆菌及检测
通过冻融法将质粒pBI121-AtMYB2导入农杆菌LBA4404，PCR检菌，选出阳性菌落LBA4404-pBI121-AtMYB2（图3-1）。
1 2 M
图3-1 PCR检测LBA4404-pBI121-AtMYB2电泳图
Fig.3-1 Agarose gel electrophoresis of PCR analysis of LBA4404-pBI121-AtMYB2 1,LBA4404 PCR product; 2,LBA4404-pBI121-AtMYB2 PCR product;M,DL2000 DNA Maker
3.2 农杆菌LBA4404-pBI121-AtMYB2转化烟草
经农杆菌LBA4404-pBI121- AtMYB2浸染的烟草叶片在筛选培养基上培养15天开始分化出不定芽（图3-2a），而对照烟草叶片没有分化且开始黄化（图3-2b）。将分化出的不定芽转移至继代培养基中继续筛选后，逃逸芽开始黄化，转化芽正
30
常生长（图3-2c）。筛选出的抗性芽在附加抗生素的1/2MS培养基上生根（图3-2d）。
a b
c d
图3-2 农杆菌LBA4404-pBI121-AtMYB2转化烟草 Fig.3-2 Transgenic tobacco of LBA4404-pBI121-AtMYB2
3.3 转基因植株的PCR检测
将筛选得到的转基因烟草，用CTAB法分别提取总DNA进行电泳（图3-3），均出现长度为23kb左右的DNA片段，烟草的基因组保持了良好的完整性，也没有弥散现象。
M CK1 CK2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
图3-3 CTAB法提取部分转基因烟草DNA检测电泳图 Fig3-3 Total DNA of partial transgenic tobacco plants
M,λ-Hind Ⅲ DNA Marker；CK1,野生烟草；CK2，转C5A烟草；1-16，转AtMYB2烟草
31
分别以上述转基因烟草总DNA为模板，以F/R为引物进行PCR扩增，转AtMYB2基因烟草（1-16）有目的片段，而对照组（CK1，CK2）没有（图3-4），从而初步证明外源基因已经转入烟草中。
图3-4 部分转基因烟草的PCR检测电泳图
Fig.3-4 Agarose gel electrophoresis of PCR analysis of partial transgenic tobacco plants
1-16，转AtMYB2烟草PCR 产物；CK1，野生烟草PCR 产物；CK2，
转C5A烟草PCR 产物；M,DL2000 DNA Maker
3.4 转基因植物的RT-PCR检测
提取了PCR检测呈阳性的转基因烟草的总RNA(图3-5)，RT-PCR反应表明，除4号外，大部分转基因烟草中的AtMYB2基因已经表达，图3-5。
M ck1 ck2 1 2 3 4 5 6 7 8
图3-5 部分转基因烟草总RNA
Fig3-5 Total RNA of partial transgenic tobacco plants M,DL2000 DNA Make；CK1，野生烟草RNA； CK2，转C5A烟草RNA；1~8转AtMYB2烟草RNA
32
M ck1ck2 1 2 3 4 5 6 7 8
图3-6 部分转基因烟草RT-PCR检测
Fig.3-6 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR analysis of partial transgenic tobacco plants
M,DL2000 DNA Make；CK1，野生烟草PCR 产物； CK2，转C5A烟草PCR 产物；1~8转AtMYB2烟草PCR 产物
3.5 转基因植株的GUS组织化学染色检测
经过GUS组织化学定位染色，转基因烟草叶片上出现蓝色斑点，但转AtMYB2-C5A基因烟草（图3-7c）与转C5A烟草（图3-7b）相比，蓝色更深，野生烟草（图3-7a）叶片不能被染色。
33
图3-7 部分转基因烟草的GUS组织化学染色
Fig.3-7 Histochemical expression of the GUS reporter gene of partial transgenic tobacco leaves
34
3.6 转基因植株的GUS荧光定量分析
选取GUS染色较好和RT-PCR检测阳性的转AtMYB2基因烟草10个株系，利用4-MU荧光定量检测方法，对转基因烟草叶片中GUS酶活性进行定量分析。由于不同的转基因植株因外源基因的插入位置的不同使其在表达水平上存在着差异，但是转AtMYB2基因的双价转基因烟草比单独转C5A烟草的GUS活性显著提高，最多提高了6倍以上（如图3-8）。
10GUS activity(nmol/min*mg protein)9876543210C5A1239151617182022
图3-8 转基因烟草叶片GUS蛋白活性分析
Fig.3-8 GUS enzyme average activities of partial transgenic tobacco leaves
4 讨论
拟南芥中的AtMYB2基因是第一个被发现的受ABA和脱水诱导表达的蛋白。AtMYB2与rd22基因启动子上特异的识别位点（-CTAACCT-）相结合，能促进下游基因的表达，进一步增加植物的耐受性[10]。
CMO基因启动子上也有AtMYB2转录因子蛋白的识别位点（-CTAACCT-），将AtMYB2基因转入含有pC的转基因烟草中，转AtMYB2基因的双价转基因烟草比单独转C5A烟草的GUS活性显著提高，AtMYB2转录因子增强了pC序列下游报告基因GUS的表达活性，说明AtMYB2转录因子与CMO基因启动子可以相互作用，但AtMYB2蛋白是直接与pC启动子作用，还是间接发挥功能，本实验并不能得出结论，可通过凝胶阻滞分析实验、酵母单杂交实验进一步确认分析。
35
5 小结
① 通过冻融法将构建好的pBI121- AtMYB2质粒导入农杆菌LBA4404，获得了可以用于植物转化的工程菌LBA4404-pBI121- AtMYB2。
② 通过叶盘法进行烟草转化，获得了具有卡那霉素抗性的转基因烟草。 ③ 通过PCR检测，获得了转基因阳性植株；半定量RT-PCR检测表明外源基因在转基因植株表达；GUS组织化学分析和GUS荧光定量分析表明，转双价基因烟草的GUS活性显著提高，说明AtMYB2转录因子与CMO启动子相互作用，促进了其下游基因的表达。
36
参考文献
[1] 吴乃虎(2001).《基因工程原理》(下册). 北京: 科学出版社, 88~97.
[2] LIU Qiang, ZHANG Gui-You, CHEN Shou-Yi (2001). Structure and regulatory function of
plant transcription factors. Chinese Science Bulletin, 46(4): 271~278.
[3] Klempnauer KH, Gonda TJ, Bishop JM (1982). Nucleotide sequence of the retroviral leukemia
gene v-myb and its cellular progenitor c-myb: the architecture of a transduced oncogene. Cell, 31(2 Pt 1): 453~63.
[4] J Paz-Ares, D Ghosal, U Wienand, P A Peterson, H Saedler (1987). The regulatory cl loeus of
Zea mays encodes a Protein with homology to Myb Proto-oneogene products and with struetural similarities to transcriptional activators. EMBOJ, 6(12): 3553~3558.
[5] Hailing Jin, Cathie Martin (1999). Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene
family. Plant Mol Biol, 41: 577~585.
[6] Furukawa K, Oda M, Nakamura H. (1996). A small engineered protein lacks structural
uniqueness by increasing the side-chain conformational entropy. Proc Natl Acad Sci U S A, 93(24): 13583~13588.
[7] Yoo JH, Park CY, Kim JC, Heo WD, Cheong MS, Park HC, Kim MC, Moon BC, Choi MS,
Kang YH, et al (2005). Direct Interaction of a Divergent CaM Isoform and the Transcription Factor, MYB2, Enhances Salt Tolerance in Arabidopsis. J Biol Chem, 280(5): 3697~706. [8] Kazuhiro Ogata, Souichi Morikawa, Haruki Nakamura, Hironobu Hojo, Shoko Yoshimura,
Ruoheng Zhang, Saburo Aimoto, Yuko Ametani, Zenzo Hirata, Akinori Sarai et al (1995). Comparison of the free and DNA complexed forms of the DNA-banding domain of c-MYB. Nature Atruct Biol, 2: 309~320.
[9] Takeshi urao, Masa-akiNoji, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1996). A
transcriptional activation domain of ATMYB2,a drought-inducible Arabidopsis Myb-related protein. The Plant Journal, 10(6): 1145~1148.
[10] Iwasaki T, Yamaguchi-Shinozaki K, shinozaki K (1995). Identification of a cis-regulatory
region of a gene in Arabidopsis thaliana whose induction by dehydration is mediated by abscisic acid and requires protein synthesis. Mol Gen Genet, 247: 391~398.
[11] Hoeren FU, Dolferus R, Wu Y, Peacock WJ, Dennis ES (1998). Evidence for a Role for
AtMYB2 in the Induction of the Arabidopsis Alcohol Dehydrogenase Gene (ADH1) by Low Oxygen. Genetics, 149(2): 479~490.
[12] Wang S, Wang JW, Yu N, Li CH, Luo B, Gou JY, Wang LJ, Chen XY(2004). Control of plant
trichome development by a cotton fiber MYB gene. Plant Cell, 6(9): 2323~3. [13] Lipsick JS (1996). One billion years of MYB. Oncogene, 13: 223~225.
[14] Chen Yanhui, Yang Xiaoyuan, He Kun, Liu Meihua, Li Jigang, Gao Zhaofeng , Lin Zhiqiang ,
Zhang Yunfei , Wang Xiaoxiao, Qiu Xiaoming et al (2006). The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis: expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family. Plant Molecular Biology, 60: 107~124.
[15] Kamiya T, Kawabe A, Miyashita NT (2002). Nucleotide polymorphism at the Atmyb2 locus of
the wild plant Arabidopsis thaliana，Genet Res. 80(2): 89~98.
[16] Yu EY, Kim SE, Kim JH, Ko JH Cho MH, Chung IK (2000). Spquence specific DNA
recognition by the MYB-like domain of plant telomeric protein RTBP1. J.Biol Chem, 275: 24208~24214.
37
[17] Masaki Ito (2005). Conservation and diversification of three-repeat Myb transcription factors in
plants. J Plant Res, 118: 61~69.
[18] Abe H, Yamaguchi-Shinozaki K, Urao T, Iwasaki T, Hosokawa D, Shinozaki K (1997). Role
of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Droughtand Abscisic Acid-Regulated Gene Expression. The Plant Cell, (9): 1859~1868.
[19] Goicoechea M, Lacombe E, Legay S, Mihaljevic S, Rech P, Jauneau A, Lapierre C, Pollet B,
Verhaegen D, Chaubet-Gigot N et al (2005). EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem, regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis. Plant J, 43(4): 553~67.
[20] Leech MJ, Kammerer W, Cove DJ, Martin C, Wang TL (1993). Expression of myb-related
genes in the moss,Physcomitrella patens. The Plant Journal, 3(1): 51~61.
[21] Liu C J, Blount J W, Streele C L, Dixon R A (2002). Bottlenecks for metabolic engineering of
isoflavone glyconjugates in Arabidopsis.Proc. Ncad. Sic. USA, 99:14578~14583.
[22] Jin H, Cominelli E, Bailey P, Parr A, Mehrtens F, Jones J, Tonelli C, Weisshaar B, Martin
C(2000). Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens in Arabidopsis.EMBO J, 19: 6150~6161.
[23] Aharoni A, De Vos C H, Wein M, Sun Z, Greco R, Kroon A, Mol J N (2001). O’Connell A P.
The strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco,Plant J, 28:319~322. [24] 张贵友,田瑞华,戴尧仁 (2001). 植物细胞凋亡的研究进展《生物工程进展》, Vol. 21 ,No. 6, 22~27.
[25] Yang Y, Klessig DF (1996). Isolation and characterization of a tobacco mosaic virus-inducible
myb oncogene homolog from tobacco. PNAS, 93(25): 1497214977. [26] Schwechheimer C, Zourelidou M, and Bevan MW. Plant transcription factor studies。Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1998, 49:127~150.
[27] Ma J (1987). Prashne M.Deletion analysis of Gal4 defines two transcriptional activating
segments.Cell, 43:729~736.
[28] Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, et al (1991).The two-hybrid system:a method to identify
and clone genes for proteins that interact with a protein of interest.Proc Natl Acad Sci USA, 88:9578~9582.
[29] Chevray P, Nathans D (1992). Protein interaction cloning in yeast:identification of mammalian
proteins that react with the leucine zipper of Jun.Proc Natl Acad Sci USA, 89:5789~5793. [30] Dalton S, Treisman R (1992).Characterization of SAP-1,a protein recruited by serum response
factor to the c-fos serum response element. Cell, 68:597~612.
[31] Bartel PL, Fields S (1997). The Yeast Two-Hybrid System. New York:Oxford University
Press,289~297.
[32] Vojtek AB, Hollenberg SM, Cooper JA (1993). Mammalian Ras interacts directly with the
serine/threonine kinase Raf. Cell, 74:205~214.
[33] Inouye C, Remondelli P, Karin M, et al (1994).Isolation of a cDNA encoding a metal response
element binding protein using a novel expression cloning procedure: the one hybrid system. DNA Cell Biol, 13:731~742.
[34] Lei Juan-Li, Xu Zhi-Hao (2002).Application of transposons in the plant functional genomics.
Acta Agriculturae Zhejianggensis, 14(5):291~296.
[35] Tang Wei, Vanessa Samuels, Janet Ogbon, Aquilla McCoy (2001). Functional genomics: Gene
38
identification via T-DNA mediated gene trap tagging in plant. J Forest Res, 12(1):1~8. [36] Jiang Shu-Ye (2003). Rice mutant population and its applications on functional genomics.
Molecular Plant Breeding, 1(2):137~150.
[37] Zhang Li-Sheng (2003). Chen Da-Yuan. RNA interference and its promising future.
Hereditas(Beijing). 25(3):311~344.
[38] Liu L, White M J, MacRae T H (1999). Transcription factors and their genes in higher plants
functional domains, evolution and regulation. Eur J Biochem, 262(2):247~257.
[39] Gatz C (1997). Chemical control of gene expression[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,
48:89~108.
[40] Gossen M, Bujard H (1992). Tight control of gene expres-sion in mammalian cells by
tetracycline-responsive promoters [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 89:5547~5551.
[41] Martinez A, Sparks C, Hart CA, et al (1999). Ecdysone agonist inducible transcription in
transgenic tobacco plants [J]. Plant J, 19:97~106.
[42] Padidam M, Gore M, Lu DL, et al (2003).Chemical-inducible,ecdysone receptor-based gene
expression system for plants [J]. Transgenic Res, 12(1):101~109.
[43] Unger E, Cigan AM, Trimnell M, et al (2002). A chimeric ecdysone receptor facilitates
methoxyfenozide-dependent restoration of male fertility in ms45 maize [J]. Transgenic Res, 11:455~465.
[44] Felenbok B (1991). The ethanol utilization regulon of Aspergillus nidulans:the alcA-alcR
system as a tool for the expression of recombinant proteins [J]. J Biotechnol, 17:11~17. [45] 朱飞舟,陈立云,何强 (2004). 转基因植株的分子检测方法概述. 杂交水稻 ( HYBRID RICE), 19 (3) :1~4.
[46] L iu Z, Mao F, Guo J T, et al (2005). Quantitative evaluation of protein-DNA interactions using
an optimized knowledge-based potential [J]. Nucleic Acids Res, 33 (2) : 546~558.
[47] Robinson SP, Jones GP (1986). Accumulation of glycinebetaine in chloroplasts provides
osmotic adjustment during salt stress. Aust J Plant Physiol, 13:659~668.
[48] Lone M I, Kueh J S H, Wyn J R G, Bright S W J (1987). Influence of proline and glycinebetaine
on salt tolerance of cultruede barely embryos. J Exp Bot. 38:479-490. [49] 许雯,孙梅好,朱亚芳,苏维埃 (2001). 甘氨酸甜菜碱增强青菜抗盐性的作用.植物学报. 43:809-814.
[50] Rhodes D, Hanson AD (1993). Quaternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in
higher plants. Annu Rev Plant Physiol, 44:357~384.
[51] Brouquisse R, Weigel P, Rhodes D, et al (1989). Evidence for a ferredoxin-dependent choline
monooxygenase from spinach chloroplast stroma. Plant Physiol, 90:322~329.
[52] Qiuli Li, Hui Yin, Dan Li, Hongfei Zhu, Yi Zhang, Weiwei Zhu (2007). Isolation and
Characterization of CMO Gene Promoter from Halophyte Suaeda liaotungensis K. Journal of Genetics and Genomics. April, 34(4): 355~361. [53] 尹辉(2007).辽宁碱蓬CMO基因启动子功能分析. 硕士论文.
[54] Doyle JJ, Doyle JL (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12(1):552~555. [55] Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987). GUS fusions: beta-glucuronidase as a
sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J, 6(13):3901~3907.
[56] Bradford MM (1976).A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem,72(1-2): 248~254.
39
.附 录
附录Ⅰ各种培养基配方
MS基本培养基：
类别 组成成分 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO4 KI
Na2Mo4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O Na2·EDTA FeSO4·7H2O
含量（mg/L）
1900 1650 370 170 440 22.30 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 37.25 27.85
大量元素
微量元素
铁盐
甘氨酸 2.0 盐酸硫胺素（B1） 0.4 有机物质
盐酸吡哆素（B6） 0.5 烟酸 0.5 肌醇 100 蔗糖3%，琼脂6.5 g/L，pH值为5.8。 LB培养基：
培养大肠杆菌：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0（固 体培养基另加琼脂15g/L）。
YEB培养基：
培养农杆菌：胰蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，牛肉膏 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蔗糖 5g/L，pH7.0（固体培养基另加琼脂15g/L）。
40
附录Ⅱ：论文中所用DNA Markers
41
附录Ⅲ：pUC19质粒图谱
42
附录IV：pBI121质粒图谱
EcoRV (11791)EcoRV (13592)SacII (14669)ori VColE1 oriT-DNA right bordeSacII (2634)
NOS PromoterpBI121 simple14758 bpnptIINcoI (3399)EcoRV (3839)EcoRV (3965)Nco I (9946)Nco I (9418)NOS TerminatorHindIII (4951)NcoI (5278) RV (9055)Eco T-DNA left border EcoRI (7983)
CaMV 35S PromoterEcoRV (5714)XbaI (5816)BamHI (5822)SmaI (5829)SnaBI (6230)EcoRV (6403)EcoRV (6634)NOS TerminatorSacI (7716)gusA43
附录V:pC5序列
TGGACCAGTAGTAGTATCTTCATTTCAACATTGGAAATAACCA -225
ABA
ATTGACTCACAAAATCAATGGTAAAAACATTTGACCTTTAACTAGCCAATTGGACTAGCC -165 cold-induced CAAT-box cold-induced cold-induced
AACAATTAATAGAATTTAAGTGAATAGTGAAATTCCCAAATAACCACACATGCAAAGGGA -105 ABA cold-induced
AGAAAAAATAGAAACACAAAGAAGGTTCTATGGTGGGGGTGAAAAGGGCAAGTAAGGCTA NaCl-induced expression +1
ACCACAAAATTATATAAATAGAGGACTTAGGGGGTGATGAAAAACCGCACAAACTTGTTA +16 TATA-box NaCl-induced expression
GTTGTATAACTCTACACAACAACACAAGCAAGAAGCTAAGCCAAACCAAGCTAAGCTTAA +76 GGAGGAATAACATTTCATCATATAATCTTAATTTAATTTAAGGTCTTGTTTGATGGCTGC
44
-45 +136
致 谢
本研究是在导师李秋莉教授悉心指导和关怀下完成的。李老师乐观的态度、平易近人的风格深深地影响着我，使我满怀信心地克服困难；李老师的严谨治学、孜孜不倦的钻研、奋斗精神给我留下了深刻的印象；李老师广博的学识、敏锐的洞察力、对科学的执着追求和开拓、进取精神深深地激励着我，并使我终生受益。从师三年虽有辛苦但更有收获，我点滴进步的背后都有导师辛勤的劳动和谆谆的教诲，没有导师的培养就不会有我今天的成绩。在此学生致以深深的敬意和谢意！
在研究过程中，还得到了宁淑香老师、佟少明老师、王火旭老师、杨文新老师、白凤英老师、赵元老师、张健老师的热情帮助。实验室的尹辉、张毅、李丹师姐、朱巍巍师兄、关秋玲、于壮、朱丽萍、郭晋燕、郑晓瑜等也为实验提供了很多帮助。我的同学们和室友也曾给予种种支持与帮助。在此向他们致以诚挚的谢意！
衷心感谢我的父母，感谢所有关心我的亲人和朋友，在我的成长和求学道路上，给予了我莫大的关怀、支持和鼓励，使我能够战胜任何困难，不断进步。在此论文完成之际，向所有帮助过我的老师和朋友们致以最诚挚的谢意！
45
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容