草甘膦抗性菌株假单胞菌P818的筛选鉴定

王冰;杜锦;向春阳;王松文;曹高燚

【摘 要】5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是除草剂草甘膦的靶标酶,转基因抗草甘磷作物主要通过转入外源EPSPS编码基因或者对外源EPSPS定点突变来获得.为了扩充草甘膦抗性基因资源,筛选新型草甘膦抗性基因,本研究分离筛选并获得了一株新型草甘膦抗性菌株,16srDNA鉴定显示该菌株属于假单胞菌,该菌株被命名为假单胞菌818.该菌株的获得为进一步筛选克隆草甘膦抗性相关基因提供了可靠保障,丰富了草甘膦抗性基因资源库,获得自主知识产权的新型草甘膦抗性基因有利于应对国外生物技术公司对该领域的垄断,有利于我国遗传改良作物的培育.

【期刊名称】《天津农业科学》 【年(卷),期】2016(022)001 【总页数】5页(P27-31)

【关键词】5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶;草甘膦;假单胞菌;抗草甘膦作物

【作 者】王冰;杜锦;向春阳;王松文;曹高燚

【作者单位】天津农学院农学与资源环境学院,天津300384;天津农学院农学与资源环境学院,天津300384;天津农学院农学与资源环境学院,天津300384;天津农学院农学与资源环境学院,天津300384;天津农学院农学与资源环境学院,天津300384

【正文语种】中 文 【中图分类】S482.4

草甘膦（Glyphosate）作为一种重要的除草剂，具有高效、低毒、在环境中降解快、广谱灭生等优良特性，且制备工艺简单。草甘膦因其种种突出的特性，使其在几十年间得以迅速发展，并成为当今农业生产中生产量及销量最大、使用面积最广的一种除草剂。草甘膦的作用机理主要是竞争性地抑制莽草酸途径中的催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和三磷酸莽草酸（S3P）生成5－磷酸烯醇式丙酮酰－莽草酸－3－磷酸（EPSP）的5－磷酸烯醇式丙酮酰－莽草酸－3－磷酸合酶（EPSPS），通过占据EPSPS与底物结合的活性位点导致莽草酸途径的受阻，进而使植物体内莽草酸大量积累，最终使植物产生草甘膦毒害[1]。EPSPS由aroA基因编码，主要分为I型、II型及III型等3类。I型EPSPS主要来源于植物、大肠杆菌(Escherichia coli)及部分微生物，一般对草甘膦敏感，不具有草甘膦抗性；II 型EPSPS主要来源于农杆菌(Agrobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)等一些可以耐受极端环境的菌株，一般对草甘膦具有耐受性；III型EPSPS由于其结构上的特异性将其单独列出，此类EPSPS数量较少。

生物体为了解除草甘膦的胁迫作用，主要通过4种途径来获得草甘膦抗性：（1）过量表达EPSPS获得草甘膦抗性；（2）定向进化EPSPS，降低对草甘膦的敏感而获得草甘膦抗性；（3）降解草甘膦；（4）通过非靶向性的调控作用获得草甘膦抗性[2]。这4种途径也是利用现代农业生物技术培育抗草甘膦作物的主要策略。 在现代农业生产中，生物技术所占比重越来越大，抗草甘膦转基因作物在国内外得到了飞速的发展，然而困扰抗草甘膦转基因作物发展有一个重要因素就是稀缺的基因资源。当前广泛应用于转基因作物生产的草甘膦抗性基因，主要是来源于Agrobacterium的CP4及来源于E.coli等I型EPSPS的TIPS突变体（第97位

的Thr突变为Ile，第101位的Pro突变为Ser）[3-4]，以及由先锋公司开发的草甘膦乙酰转移酶基因GAT[5]。我国抗草甘膦转基因作物的发展与国外相比存在不小的差异，其中一个重要的原因就是紧缺的基因资源或者是少数性状优良的基因资源由于专利因素被国外公司牢牢把控。基于此，应该扩宽草甘膦抗性基因的来源，获取新型的草甘膦抗性基因，推动我国现代农业的发展。本研究通过逐步稀释法筛选草甘膦污染土壤微生物，分离获得一株新型草甘膦抗性菌株假单胞菌818。新的草甘膦抗性菌株的筛选鉴定，为下一步克隆草甘膦抗性基因奠定了基础。 1.1 草甘膦抗性菌株的筛选

草甘膦极端污染的土壤取自草甘膦生产工厂的受多年草甘膦污染的废水排出处。取1 g土壤用去离子水稀释，之后采用逐步稀释法，将含土壤微生物的水溶液分别涂布在含有200 mmol·L-1草甘膦的M9固体培养基上。将能够生长的草甘膦抗性菌落转接划线于新的M9固体培养基上进行菌株纯化，最后将筛选到的草甘膦抗性菌株用液体LB培养基培养，加入15%体积比的甘油，液氮速冻后于-80℃保存。 1.2 细菌基因组DNA的提取

细菌基因组DNA提取参照北京全式金生物技术有限公司EasyPureTM Genomic DNA Kit说明进行。洗脱出的DNA于－20℃保存。 1.3 16srDNA的扩增及DNA片段的回收纯化

提取细菌基因组DNA后，用16srDNA引物进行扩增，鉴定微生物所属的类型。所用引物为：上游5‘-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；下游5‘-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。DNA扩增片段跑1%琼脂糖胶进行检测。DNA回收产物通过北京天根生化生物技术有限公司试剂盒TIANgel Midi Purification Kit操作说明进行。收集DNA溶液，并保存于－20℃备用。 1.4 序列比对

序列比对通过NCBI在线网站进行比对(http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.5 系统进化树分析

在NCBI数据库中检索已知假单胞菌EPSPS氨基酸序列，分析其系统进化关系。使用MEGA6.0[6]里的Neighbor-Joining方法构建进化树，具体算法采用pair-wise deletion，自展值1 000次。 2.1 草甘膦抗性菌株的筛选

草甘膦污染的土壤来自于生产草甘膦的工厂附近，其处在极端污染的环境下。取来自于极度污染环境下的草甘膦土壤，用去离子水将其溶解，采用稀释涂板法培养细菌，取上层清液，逐步稀释，稀释到106，在含有不同浓度草甘膦的M9培养基上进行培养。

同时，取土壤上清液在含有300 mmol·L-1草甘膦的液体M9培养基中进行稀释培养，按1∶100倍稀释，共稀释6次，以消耗完土壤中的营养物质。置于28℃的培养箱中，每12 h观察1次，培养3 d后取出，将其放在避光处培养。 根据前面的方法，培养了稀释103，104，105，106后的培养基，得到数个能够耐受草甘膦胁迫的菌斑，通过转接保存这些菌斑，笔者获得纯化了的草甘膦抗性菌株。将获得的草甘膦抗性菌株转接到不含抗生素的LB液体培养基中进行培养，用甘油混匀后液氮速冻，之后保存于-80℃冰箱中。笔者选择其中一株可以稳定耐受300 mmol·L-1浓度草甘膦的菌株(图1)进行下一步试验，根据笔者鉴定的顺序，该菌株命名为818。

2.2 细菌基因组DNA的提取及16srDNA的鉴定

818菌株用不含抗生素的LB液体培养基进行培养，收集菌液。细菌基因组DNA提取参照北京全式金生物技术有限公司EasyPureTM Genomic DNA Kit说明进行。获得的细菌基因组DNA跑1%浓度琼脂糖，鉴定提取质量（图2）。提取细菌基因组DNA后，用16srDNA引物进行扩增，鉴定微生物所属的类型。所获得的DNA序列经纯化后直接送测序，经过序列拼接及比对，获得818菌株的

16srDNA序列。

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中对菌株818 的16srDNA进行序列比对，比对结果显示818菌株很可能是一种假单胞菌，与Pseudomonas pseu

doalcaligenes strain LCB14具有最近的亲缘关系，其在NCBI中的比对结果如表1所示。

据报道，假单胞菌可以在极端恶劣的环境条件下生活，当前得到的EPSPS编码基因，有很多都是从不同种的假单胞菌中克隆出来，比如来源于恶臭假单胞菌的P4G-1[7-8]，来源于荧光假单胞菌的G2[9]，来源于斯氏假单胞菌的A1501[10-11]，来自于盐单胞菌的HTG7[12]，来自于假单胞菌的PG2982[13-14]。本研究得到的818菌株可以耐受300 mmol·L-1草甘膦的胁迫，根据鉴定顺利将其命名为假单胞菌818。 2.3假单胞菌EPSPS序列系统进化分析

检索NCBI数据库，笔者调出了部分假单胞菌EPSPS序列，与其他典型物种EPSPS序列构建系统进化树。利用MEGA6.0进行序列比对并进行系统进化分析，采用Neighbor-joinng方法，具体算法采用Pair-wise deletion，自展值1 000次。

EPSPS根据其对草甘膦的敏感程度可以分为3类：I型EPSPS对草甘膦敏感，不具备草甘膦抗性；II型EPSPS一般来源于土壤农杆菌和细菌，对草甘膦具有一定程度的耐受性；近年来，又鉴定出了个别在结构上比较特异的EPSPS，其根据通用的EPSPS分类方法，并不能很清晰地划分，因此被称为III型EPSPS。假单胞菌EPSPS具有典型II 型EPSPS的保守结构域，大多具有天然的草甘膦抗性。II型EPSPS其96位的Gly在突变为Ala后其对底物PEP和S3P的亲和能力大大增强，而减小了与草甘膦的亲和能力，因此产生了较高的草甘膦抗性[3]。对已知假单胞菌EPSPS氨基酸序列进行系统进化分析，结果显示假单胞菌属于典型II型EPSPS（图3），这预示了本研究所鉴定的假单胞菌818其EPSPS序列也应该属于II型

EPSPS，通过克隆该编码基因，并对其进行定向突变能够获得具有较高草甘膦抗性的新基因。

本研究从受草甘膦常年污染的土壤中筛选到了一株新型的草甘膦抗性菌株，经过16srDNA鉴定，显示其为假单胞菌，命名为假单胞菌818，其可以耐受高达300 mmol·L-1的草甘膦的胁迫，该菌株的发现为进一步克隆其草甘膦抗性基因奠定了基础。

在高浓度草甘膦胁迫条件下生长的菌株在适应环境的过程中，会形成自身的调控机制，以避免草甘膦的伤害。微生物对草甘膦的避害主要通过两种途径来进行：一是通过EPSPS的进化维持莽草酸途径的正常进行；二是降解草甘膦。Priestman等人鉴定了一株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），它可以耐受一定浓度的草甘膦胁迫，进一步分析表明，其EPSPS可以直接以莽草酸为底物，维持莽草酸途径的进行[15-16]。Pseudomonas sp.strain PG2982可以通过裂解草甘膦的C－P键，而消除草甘膦的毒害作用[14]。

假单胞菌是可以在极端环境条件下生长的一类细菌，其可以耐受高盐、低氧、高温等极端环境，当前研究所发现的对草甘膦不敏感的EPSPS编码基因大多都是从这类菌株中克隆的[7,11,13-14]，对其进行深入研究有可能发现一些新的与逆境胁迫相关的作用机制。

本研究鉴定的假单胞菌818在M9缺陷型培养基中可以耐受高达300 mmol·L-1的草甘膦的胁迫，暗示其aroA基因可能具有较高的草甘膦抗性。下一步笔者将克隆假单胞菌818的aroA基因，并通过转基因试验对其草甘膦抗性做鉴定。

【相关文献】

[1] STEINRUCKEN H C, AMRHEIN N.The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5 -enolpyruvyl -shikimic acid-3-phosphate synthase [J].Biochem Biophys Res

Commun,1980,94: 1207-1212.

[2]曹高燚，陈荣荣，杜锦,等.5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因AM79aroA的活性位点分析[J].农业生物技术学报,2015, 23(5): 606-616.

[3] FUNKE T, HAN H, HEALY-FRIED M L, et al.Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103: 13010-13015.

[4] FUNKE T, YANG Y, HAN H, et al.Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli [J].J Biol Chem,2009, 284: 9854-9860. [5] CASTLE L A, SIEHL D L, Gorton R, et al.Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene [J].Science,2004,304: 1151-1154.

[6] TAMURA K, STECHER G, PETERSON D, et al.MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 [J].Mol Biol Evol,2013, 30: 2725-2729.

[7] SUN Y C, CHEN Y C, TIAN Z X, et al.Novel AroA with high tolerance to glyphosate, encod ed by a gene of Pseudomonas putida 4G-1 isolated from an extremely polluted environment in China [J].Appl Environ Microbiol ,2005, 71: 4771-4776.

[8] YAN H Q, CHANG S H, TIAN Z X, et al.Novel AroA from Pseudomonas putida confers tobacco plant with high tolerance to glyphosate[J].PLoS One ,2011( 6): 19732.

[9] DUN B Q, LU W, PING S Z, et al.Isolation of a glyphosate tolerance N -acetyltransferase gene and expression in E.coli[J].High Technology Letters ,2006,16: 943-947.

[10] LI L, LU W, HAN Y, et al.A novel RPMXR motif among class II 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases is required for enzymatic activity and glyphosate resistance[J].J Biotechnol,2009,144: 330-336.

[11] LIANG A, SHA J, LU W, et al.A single residue mutation of 5 -enoylpyruvylshikimate -3 -phosphate synthase in Pseudomonasstutzeri enhances resistance to the herbicide glyphosate [J].Biotechnol Lett ,2008, 30: 1397-1401.

[12] LIU Z, PAN Z, XU Y, et al.Cloning and expression of a 5 -enolpyruvylshikimate -3 -phosphate synthase gene from Halomonas variabilis[J].DNA Seq,2006,17: 208-214. [13] FITZGIBBON J, BRAYMER H D.Phosphate starvation induces uptake of glyphosate by Pseudomonas sp.strain PG2982[J].Appl Environ Microbiol,1988,54: 1886-1888.

[14] SHINABARGER D L, BRAYMER H D.Glyphosate catabolism by Pseudomonas sp.strain PG2982 [J].J Bacteriol,1986, 168: 702-707.

[15] PRIESTMAN M A, HEALY M L, BECKER A, et al.Interaction of phosphonate analogues of the tetrahedral reaction intermediate with 5 -enolpyruvylshikimate -3 -phosphate synthase in atomic detail[J].Biochemistry,2005,44: 3241-3248.[16] PRIESTMAN M A, HEALY M L, FUNKE T, et al.Molecular basis for the glyphosate-insensitivity of the reaction of 5 -enolpyruvylshikimate 3 -phosphate synthase with shikimate[J].FEBS Lett ,2005,579: 5773-5780.