发表时间：2014-12-11T09:31:49.233Z 来源：《医药前沿》2014年第22期供稿 作者： 王灿铭 郭振英 胡锦林(通讯作者)
[导读] 冷冻切片是新鲜手术标本借助在低温下（-18℃以下），使组织在短时间内达到一定硬度进行快速切片、染色的一种制片方法。王灿铭 郭振英 胡锦林(通讯作者)
（浙江省肿瘤医院 浙江杭州 310022）
【摘要】目的 分析10%福尔马林、纯丙酮、95%乙醇、甲醇4种固定液对脑组织冷冻切片H-E染色质量的影响，筛选出一种脑组织冷冻切片的最佳固定液。方法 收集手术室送检新鲜脑组织标本，经常规冷冻切片后放入不同固定液，进行H-E染色，观察脑组织冷冻切片细胞收缩程度和染色质量。结果 甲醇组细胞收缩不明显，相对于其他组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；甲醇组组织结构清晰，核浆染色鲜艳，对比度好，相对于其他组差异性显著（P＜0.001）。结论 甲醇固定脑组织染色效果好，使用方便，满足术中冷冻切片的快速、准确诊断，是脑组织冷冻切片的理想固定液。
【关键词】脑组织冷冻切片 固定液 组织收缩 染色质量
【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）22-0015-02 Quality analysis of brain tissue frozen section with different fixation solution Canming Wang，Zhenying Guo，Jinlin Hu
（Department of pathology，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou，Zhejiang 310022）
【Abstract】Objective:To screen the best fixative on brain tissue frozen section,we analysed that 4 fixatives including 10%
formalin,pure acetone,95% ethanol,and methanol impact on the quality of H&E staining quality.Methods:Fresh brain tissue specimenswere collected,and we made frozen sections in the different fixatives,and observed brain tissue shrinkage and dying quality with H&Estaining. Results:Cell shrinkage of methanol group was significantly less than other groups (P<0.05); For methanol group,organizationstructure is more clear,the color is more bright and nuclear plasma contrast is higher,relative to other groups (P<0.001).Conclusion:
methanol fixation method is effective on staining,easy to use,and contributing to the rapid and accurate diagnosis of intraoperative frozensection. Methanol is an ideal fixative for brain tissue frozen section.
【Key words】Brain tissue frozen section Fixative Tissue shrinkage Staining quality
随着医疗技术水平的提高，许多脑肿瘤得以明确诊断并进行外科治疗，而脑组织冷冻切片技术和正确的病理诊断是外科手术的有力保障。冷冻切片是新鲜手术标本借助在低温下（-18℃以下），使组织在短时间内达到一定硬度进行快速切片、染色的一种制片方法[1]。而固定是脑组织冷冻切片的关键，笔者选取几种常用的固定液，通过H-E染色后观察各自固定效果对染色结果的影响，筛选出一种适合脑组织冷冻切片的最佳固定液。 1 材料与方法
1.1 材料与设备：选取我院2012年01月至2014年4月送检冷冻切片的脑组织标本150例。德国Leica CM1900冷冻切片机，日本产Feather一次性刀片，医用耦合剂。
1.2 固定液：①10%福尔马林；②纯丙酮；③95%乙醇；④甲醇。 1.3 试剂 Gill改良苏木素染色液、醇溶性伊红、梯度酒精和二甲苯等。
1.4 分组 每例脑组织标本常规冷冻切片切2～3张后，根据研究目的分为4组，各组切片例数为：①10%福尔马林组73例；②纯丙酮组70例；③95%乙醇组79例；④甲醇组82例。
1.5 方法：常规脑组织冷冻切片，厚度8μm左右，放入不同固定液中固定1min，Gill改良苏木素染色液染色1min，水洗后直接用温水（45℃左右）返蓝，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后显微镜下比较4种固定液的HE染色结果。
1.6 切片质量评判标准：脑组织冷冻切片完整，无破碎和冰晶，根据镜下细胞的收缩程度评判：细胞基本形态正常，无明显收缩
（+）；细胞收缩（++）；细胞收缩严重（+++）。根据切片染色质量评判：组织结构清晰，细胞核染色鲜艳，核浆对比好（+）；组织结构清晰度一般，染色质略模糊，核浆着色不鲜艳（++）；染色质模糊不清或核仁未见，核浆对比差，层次不清（+++）。
1.7 数据处理：采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计分析，计数资料用率（%）表示，行χ2检验，比较差异用P＜0.05表示有统计学意义。 2 结果
2.1 4组脑组织冷冻切片镜下细胞收缩程度比较 镜下观察细胞的收缩程度，甲醇组收缩要小于其他组，与10%福尔马林组、纯丙酮组、95%乙醇组比较差异有统计学意义（χ2=2.455，P＜0.05）见表1 表1 4组脑组织冷冻切片细胞收缩程度比较 n（%）
固定液 n + + + +++ 10%福尔马林组 73 63（86.30） 8（10.95） 2（2.73）
纯丙酮组 70 48（68.57） 12（17.14） 10（14.29） 95%乙醇组 79 55（69.62） 13（16.46） 11（13.92） 甲醇组 82 78（95.12） 4（4.88）
P＜0.05表示甲醇组相对于10%福尔马林组、纯丙酮组、95%乙醇组比较有差异性。
2.2 4组脑组织冷冻切片染色质量的比较 根据切片染色质量的评判标准，甲醇组组织结构清晰，核浆染色鲜艳，对比度好，染色质量等级（+）的比率（93.90%）高于其他组，通过统计分析发现，甲醇组相对于其他组有显著差异性（χ2=5.556，P＜0.001）。 表2 4组脑组织冷冻切片染色质量比较 n（%） 固定液 n + ++ +++
10%福尔马林组 73 64（87.67） 7（9.59） 2（2.74） 纯丙酮组 70 50（71.43） 15（21.43） 5（7.14） 95%乙醇组 79 56（70.89） 18（22.78） 5（6.33）
甲醇组 82 77（93.90） 5（6.10）
P＜0.001表示甲醇组相对于10%福尔马林组、纯丙酮组、95%乙醇组比较有显著差异性。 3 讨论
脑组织冷冻切片要求制片快速，防止冰晶出现和细胞肿胀。而固定的作用在于使蛋白变性、凝固、沉淀，保持细胞、组织原有的形态[2]。固定是影响脑组织冷冻切片质量的主要因素。而固定液的选择就是为了最大限度地缩小冰冻切片与石蜡切片的差异性[3]。甲醛是最为常用的固定液，4%的甲醛水溶液即为10%福尔马林，通过使蛋白质分子发生交联而产生作用。甲醛对脑组织无明显收缩和膨胀作用，但甲醛固定冰冻切片固定时间长，需要10分钟以上,如果仅固定5秒钟，则切片固定不佳，组织染色无论是组织结构清晰度还是细胞核细胞质的对比染色效果都达不到要求[4]（图1）。而且，用10%福尔马林固定脑组织冷冻切片易脱片。因此，10%福尔马林不是脑组织冷冻切片的最佳固定液。丙酮渗透力很强，具有固定兼脱水作用。可使蛋白质沉淀凝固，对核的固定差。经过丙酮固定的脑组织冷冻切片，结构不清晰，细胞核的固定较差，收缩明显，对比度不佳（图2）。乙醇固定的作用基本与丙酮相同，95%乙醇渗透力强，但组织固定后表层固缩，组织收缩显著、变硬，并伴有形态学改变；且核着色不良[5]，对比度一般（图3）。甲醇为沉淀类固定剂，渗透力较强，收缩性又比乙醇等小。据文献报道，甲醇固定的新鲜组织细胞形态良好，可以固定核染色质及其部分内容物、核膜及完好地细胞质，胶质也得到了很好地固定[6]。脑组织含水较丰富，质地较软，结构疏松等特点，易出现冰晶等现象，在甲醇较强的渗透力和迅速沉淀蛋白的作用下，细胞内着色迅速，又对细胞内的水分有一定的吸附作用，降低了冰晶的出现率。本文研究显示，82例甲醇固定脑组织冷冻切片收缩程度为（+++）和染色质量为（+++）的都没有出现，细胞收缩不明显，染色质量较好（图4）。而且甲醇配置简单，价格低廉，同时能满足术中冷冻切片的快速、准确诊断，是一种理想的脑组织冷冻切片固定液。 参考文献
[1] 孟黎明.冰冻诊断的意义及开放式冰冻制片的讨论[J].临床和实验医学杂志,2011，10(9):713-714. [2] 龚志锦,詹容洲.病理组织制片和染色技术[M].上海:科学技术出版社,1994.
[3] 梁艳清.六种固定液对冰冻切片苏木素-伊红染色效果的比较[J].解剖学研究,2012，34（2）:159-160.
[4] 董愉,梁英杰,吴惠群,等.不同固定液对不同组织冷冻切片HE染色效果的探讨[J].临床医学工程,2011,18(10):1584-1585. [5] 高美欣,黄雄飞,肖志芸,等.不同固定液对冷冻组织切片HE染色影响的比较[J].福建医科大学学报,2001,35(4):367.
[6] Kumarasinghe MP. Methanol as an alternative fixative for cytological smears[J].Malaysian J Pathol,1997,19(2):137-140. 以下为图片：图1—图4
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