纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的培养条件优化

第29卷第6期2019第6年期12月皮革科学与工程29(6):25-29Dec.2019LEATHERSCIENCEANDENGINEERINGdoi:10.19677/j.issn.1004-7964.2019.06.005纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的培养条件优化赵阳,杨阳,赵长青*（四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾644000）摘要：通过对能够产微生物絮凝剂（具有处理制革废水的能力）的纺锤芽孢杆菌进行培养条件优化，以期提高该纺锤芽孢杆菌所产微生物絮凝剂的絮凝活性。以絮凝率的大小为指标，首先采用单因素实验确定了纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的最适培养温度为31℃，最佳接种量为6%，最适pH为5和6，最佳培养时间为48h。然后，4采用L9(3)正交实验，确定了纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的最适培养温度为33℃，最佳接种量为6%，最适pH为5，最佳培养时间为54h。与初始培养条件相比，在优化培养条件下制得微生物絮凝剂的絮凝率从46.9%提高到了62.1%，增长幅度为32.4%。通过对纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的培养条件进行优化，为该纺锤芽孢杆菌所产微生物絮凝剂在制革废水处理应用提供了参考。关键词院微生物；絮凝剂；培养；纺锤芽孢杆菌中图分类号院X794文献标志码院AOptimizationofCultureConditionsforProducingMicrobialFlocculant(CollegeofBioengineering,SichuanUniversityofScienceandEngineering,Yibin644000,China)Abstract:InordertoimprovetheflocculationactivityofthemicrobialflocculantwhichcantreattannerywastewaterandwasproducedbyBacillusfusiformis,thecultureconditionsofBacillusfusiformiswereoptimized.Takingtheflocculationrateasanindex,theoptimumculturetemperature,inoculationquantity,pHandculturetimeofBacillusfusiformisproducingbioflocculantweredeterminedbysinglefactorexperimentat31益,6%,5or6and48hrespectively.Then,theorthogonaltestforfourfactorsandthreelevels(L9(34))wasusedtodeterminetheoptimumtemperaturefortheproductionofbioflocculantbyBacillusfusiformis,whichwas33益.Andtheoptimuminoculationconcentrationwas6%,theoptimumpHwas5,andtheoptimumculturetimewas54h.Comparedwiththeinitialcultureconditions,theflocculationrateofthemicrobialflocculantspreparedundertheoptimizedcultureconditionsincreasedfrom46.9%to62.1%,withanincreaseof32.4%.ThusthecultureconditionsofmicrobialflocculantproducedbyBacillusfusiformiswereoptimized,whichwascontributetotheapplicationofthemicrobialflocculantproducedbyBacillusfusiformistotreattannerywastewater.Keywords:microbialflocculant;optimizationofcultureconditions;bacillusfusiformis;flocculationactivity制革工业生产主要包含脱脂、浸灰脱毛、软化、鞣制、染色加工、干燥、整饰等工序过程[1]。加工过程中需要多种化工原料部分化工原料进入废水中，导收稿日期：2018-10-18基金项目：四川省科技厅项目（编号：2018RZ0046）;四川省教育厅项目（编号：18ZA0343）第一作者简介：赵阳（1995-），男，硕士研究生。*通信联系人：赵长青（1981-），女，博士，教授，主要从事环境微生物方面的研究。致制革废水的成分复杂，含有多种污染物质和有毒物质[2-3]。目前处理制革废水的絮凝剂主要有无机絮凝剂、有机高分子絮凝剂和微生物絮凝剂三种。无机絮凝剂包括硫酸铝、氯化铝、硫酸铁、氯化铁等，其中一种由美国最早研发的硫酸铝无机絮凝剂仍在使用，并在絮凝剂领域占有相当一部分。其特点为反应速度快、适用范围广、脱色效果好、易控制、不易产生二次污染等[4]。然而，它也存在很明显的缺点，比如用量大、絮凝效果低、成本高、腐蚀性强等[5]。26皮革科学与工程第29卷有机高分子絮凝剂是20世纪中后期才流行起来的一类新型废水处理剂，主要分为合成有机高分子絮凝剂和天然高分子絮凝剂两大类。有机高分子絮凝剂与无机絮凝剂相比，前者具有用量少、絮凝速度快、pH值适用范围广，受共存盐类及环境影响小，生成污泥较少且易处理，处理效果好等优良性能，应用范围十分广泛，对节约用水、强化污水处理和回用有重要作用[6]。然而，合成有机高分子絮凝剂存在着生物降解难、残留单体有毒等问题，因此其应用存在一定的局限[7]。但对改性后的天然有机高分子絮凝剂具备无毒、生物易降解、原料来源广等优点。微生物絮凝剂是一类由微生物或其分泌物产生的代谢产物。它是通过产微生物絮凝剂菌微生物发酵、萃取、离心、冷冻干燥一系列过程而得，是具有微生物分解性、高效性、无毒性和无二次污染性的水处理剂[8-9]。微生物絮凝剂对废水中固体悬浮物、重金属离子等具有良好的絮凝效果[10]。而且微生物非常适合在含矿物质、养分的土壤等环境中生长，来源十分广泛[8]。另外，其还具备用量少、不污染环境、安全无害等优点。前期实验发现，由纺锤芽孢杆菌制备的微生物絮凝剂具有去除制革废水中污染物的能力，但此絮凝剂絮凝活性有待进一步提高。本文拟通过优化培养条件来提高该纺锤芽孢杆菌所产微生物絮凝剂的絮凝活性。1试验部分1.1材料和仪器1.1.1实验菌种及相关培养基纺锤芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)，为实验室保藏菌种。产微生物絮凝剂培养基：蔗糖50g/L、牛肉膏5g/L、氯化铝0.5g/L。LB液体培养基：酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L。LB固体培养基：酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L。1.1.2实验主要药品蔗糖、氯化钠、氯化钙、乙醇、氢氧化钠、浓盐酸，分析纯，成都市科龙化工试剂厂，氯化铝，分析纯，天津大茂化学试剂厂，高岭土，分析纯，天津市福晨化学试剂厂，琼脂，生化制剂，天津市凯通化学试剂有限公司，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨，生化制剂，北京奥博星生物技术有限责任公司。1.1.3实验主要仪器SKY-2102C恒温震荡培养箱，上海苏坤实业有限公司；YX280A手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；RJ-TDL-50A低速离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司；SW-CJ-1F电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）公司；BCD-202K冰箱，成都科龙冰箱有限公司；pHS-3C数字pH计，成都方舟科技开发有限公司；可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；SCIENTZ-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。1.2实验方法1.2.1菌种的活化在250mL锥形瓶中装入50mLLB液体培养基，于121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后从保藏菌种的斜面培养基中接入菌种，置于转速180r/min、温度35℃的摇床中培养36h，作为种子液。菌种活菌数采用平板计数法[11]。1.2.2絮凝活性的测定方法絮凝活性的高低一般用絮凝率的大小表示。通过测定高岭土悬浮液的吸光度来确定絮凝能力的大小。分别在100mL量筒内加入0.4g高岭土、80mL蒸馏水、5mL1%CaCl2和2mL待测样品，搅拌混合均匀，加蒸馏水至100mL，调pH值至7.0，摇匀，静置5min，于可见分光光度计550nm下测定待测样品的光密度值[12]。同时以用蒸馏水代替CaCl2溶液和样品的空白高龄土悬浮液作为对照组，通过浊度的减少定量表示絮凝率[13]。絮凝率计算公式为：=-×100%式中：———絮凝率，%；———加入待测样品处理后的高岭土悬液吸光度；———对照实验(空白高岭土悬浮液)测得的吸光度。1.2.3温度的优化在250mL锥形瓶中各加入100mL产微生物絮凝剂培养基，再将各培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却后在超净工作台内接入4%菌体种子液（菌体活菌浓度为6.2×105CFU/mL）。然后分别置于转速为150r/min，温度为28、31、34、37、40℃的摇床中培养36h，用高岭土悬浮液分别测定培养液的吸光度，并计算出絮凝率。通过比较在不同温度条件下絮凝率的大小，得到最佳培养温度。1.2.4接种量的优化第6期赵阳，等：纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的培养条件优化27表1正交实验各因素和水平在250mL锥形瓶中各加入100mL产微生物絮Tab.1Orthogonalfactorsandlevels凝剂培养基，再将各培养基于121℃高压蒸汽灭菌因素

20min。冷却后在超净工作台内接入2%、4%、6%、水平 8%、10%菌体种子液（菌体活菌浓度为2.5×105CFU/mL）。然后分别置于转速为150r/min、温度为31℃的摇床中培养36h，用高岭土悬浮液分别测定培养液的吸光度，并计算出絮凝率。通过比较在不同接种量条件下絮凝率的大小，得到最佳接种量。1.2.5pH的优化在250mL锥形瓶中各加入100mL产微生物絮凝剂培养基，将pH分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，再将各培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却后在超净工作台内接入6%菌体种子液（菌体活菌浓度为2.4×105CFU/mL）。然后分别置于转速为150r/min、温度为31℃的摇床中培养36h，用高岭土悬浮液分别测定培养液的吸光度，并计算出絮凝率。通过比较在不同pH条件下絮凝率的大小，得到最佳pH。1.2.6培养时间的优化在250mL锥形瓶中各加入100mL产微生物絮凝剂培养基，将pH调至5，再将各培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却后在超净工作台内接入6%菌体种子液（菌体活菌浓度为5.6×105CFU/mL）。然后分别置于转速为150r/min，温度为31℃的摇床中培养12、24、36、48、60、72h，用高岭土悬浮液分别测定培养液的吸光度，并计算出絮凝率。通过比较在不同培养时间条件下絮凝率的大小，得到最佳培养时间。1.2.7正交实验根据单因素的最优培养条件，选取其中絮凝率最高时的培养条件，列出因素水平表（表1）。本实验采用的是L9(34)正交表，按照正交表进行实验，测定絮凝率并对结果进行分析，得出这四种培养条件对絮凝率的影响程度大小次序和最优的正交组合。如表1所示，分别用A、B、C、D来表示温度、培养时间、pH、接种量四种培养条件，每个因素参照各自的最优培养条件选择三个不同的变量。根据L9(34)正交表，测定各组合的絮凝率并记录分析结果，以得出最佳的培养条件组合。1.2.8初始培养条件与优化培养条件的效果比较（1）初始培养条件下制备絮凝剂配制培养基600mL，在自然pH下，于121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却后于超净工作台内接入4%菌体种子液（菌体活菌浓度为3.8×105CFU/mL），然后置于温度35℃、转速150r/min的摇A（温度/℃） B（培养时间/h） C（pH） D（接种量/%）

1 29 36 5 5 2 31 48 5.5 6 3 33 54 6 7 床中培养36h。培养结束后，测定原始培养条件下的絮凝率，然后提取出所产的絮凝剂。（2）优化培养条件下制备絮凝剂配制培养基600mL，将pH调至5，于121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却后于超净工作台内接入6%菌体种子液（菌体活菌浓度为3.8×105CFU/mL），然后置于温度33℃、转速150r/min的摇床中培养54h。培养结束后，测定优化培养条件下的絮凝率，然后提取出所产的絮凝剂。比较在初始培养条件和优化培养条件下的絮凝率与絮凝剂产量，从而可以得到优化的效果。絮凝剂的提取方法如下：将培养液放入转速为8000r/min的高速离心机中离心10min，取上清液。然后在上清液中加入3倍体积的预冷乙醇（4℃）[14]，所得混合物在冰箱（4℃）中静置两天[15]。将混合物放入转速为5000r/min的离心机中离心15min，收集沉淀。后将离心的沉淀物于真空冷冻干燥器中干燥，得到微生物絮凝剂产品。记录产量。2结果与讨论2.1最佳温度的确定温度对纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的影响结果如图1所示。从图1中可以看出，温度为28~31℃时，其絮凝率处于上升趋势；温度为31~37℃时，其絮凝率处于下降趋势；温度37~40℃时，其絮凝率又略有上升。絮凝率在温度为31℃时最大，为75.9%；絮凝率在温度为37℃时最小，只有52.4%。在28~31℃时，可能是随着温度的升高，菌株生长代谢及细胞酶的活性增强，促进细胞外微生物絮凝剂的合成与分泌，从而使得更多的微生物絮凝剂释放到细胞外，故絮凝率也升高；31~37℃时，可能是菌株细胞酶的活性受到抑制，不利于纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂，故其絮凝率下降。虽然40℃时，其絮凝率有上升趋势，但是温度太高会导致酶失去活性，故不对温度高于40℃研究。因此，选取31℃为微生物絮凝剂的最佳温度。2.2最佳接种量的确定接种量对纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的影响28皮革科学与工程见图2。由图2可知，接种量在2%~10%内，其絮凝率大体处于上升趋势，只有在6%~8%时，其絮凝率才略有下降。接种量为2%时，可能由于接种量小，菌株短期内不能达到一定的菌种浓度，不利于絮凝剂的积累，其絮凝率只有37.7%，因而在接种量在2%~6%时，絮凝率随着接种量的增大而增大。接种量在6%~8%，可能由于接种量较大，使得培养基中菌株初始浓度过高，菌体的生长繁殖需消耗培养基中大量的营养物质，反而不利于絮凝剂的生成[12]。接种量在10%时，絮凝率效果与接种量在6%时相差不大，由于接种量不宜超过10%，故选用6%的接种量为最适接种量。2.3最佳pH的确定由于纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的培养基为弱酸性培养基，自然pH为4.84，故考察pH在3.0、4.0、5.0、6.0和7.0时对纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的影响，结果如图3所示。由图3可知，pH为3.0~5.0时，随着pH的增加，其絮凝率也增加；pH为6.0~7.0时，随着pH的增加，其絮凝率反而减小。pH为5.0和6.0时，其絮凝率最大。不同的细菌有可能适应不同的酸碱环境，pH为3.0~5.0时，可能是菌体细胞酶的活性增强，促进微生物絮凝剂的合成与分泌，从而使得更多的微生物絮凝剂释放到细胞外，故絮凝率也升高；pH为6.0~7.0时，菌体细胞酶的活性降低，抑制菌体生长，因而不利于微生物絮凝剂的生成。故初步确定最适pH为5.0和6.0。2.4最佳培养时间的确定由图4可知，培养时间为12~48h时，其絮凝率呈指数型增长，从13.9%增长到57.6%；培养时间为48~72h时，其絮凝率略有降低的趋势。培养时间为12~48h时，可能菌体处于对数期，充分利用培养基中丰富的营养物质生长、繁殖，微生物絮凝剂随着菌株浓度的增加而不断上升；培养时间为48~72h时，可能由于菌体开始衰亡，产生微生物絮凝剂减少，微生物絮凝剂的积累量趋于稳定，因此48h后絮凝剂的絮凝率下降，即絮凝活性降低。因此，初步确定最适培养时间为48h。2.5正交实验根据温度、培养时间、pH和接种量四种培养条件对纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂活性的影响，得到了提高纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂活性的单因素优化培养条件。故而选用四因素三水平正交表（L9(34)），拟对提高纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂活性的培养条件进行进一步优化。其实验结果和统计数据如表2所示。将表2中因素在第一水平时的絮凝率相加得1，再除以3得均值1，每个因素的的最大值和最小值之差得极差值[16]。值的大小直接表示该水平下絮凝率的高第29卷807060504030252831温度34/℃374043Fig.1Theflocculation图1不同温度下的絮凝率rateunderdifferenttemperatures555045403530024接种量6/%81012Theflocculation图2不同接种量下的絮凝率culturerateundermediumdifferentinoculumsizeof6050403020100234pH5678Fig.3The图flocculation3不同pHrate值下的絮凝率underdifferentpH7060504030201000122436培养时间48/h607284Fig.4The图flocculation4不同培养时间下的絮凝率rateunderdifferentculturetimeFig.2第6期赵阳，等：纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的培养条件优化29Tab.2Orthogonal表2experiment正交实验结果resultsanalysistable试验号 因素 试验结果

A温度/℃ B培养时间/ h C pH D接种量/% 絮凝率/% 1 29 36 5 5 37.22 2 29 48 5.5 6 48.77 3 29 54 6 7 51.17 4 31 36 5.5 7 32.92 5 31 48 6 5 35.27 6 31 54 5 6 54.2 7 33 36 6 6 62.71 8 33 48 5 7 65.39 9 33 54 5.5 5 54.87 K1 137.16 132.85 156.81 127.36 K2 122.39 149.81 136.56 165.68 K3 182.97 160.24 149.15 149.48 k1 45.72 44.28 52.27 42.45 k2 40.8 49.81 45.52 55.23 k60.99 53.41 49.72 49.83 R

3 20.99 9.13 6.75 12.82

Tab.3Effect表comparison3优化前后效果对比beforeandafteroptimization对比项目 培养基

初始培养基 优化培养基

增幅/%

絮凝率/% 46.9 62.1 32.4

絮凝剂产量/（g/L）

0.372 0.436 17.2 低，而值的大小反映出该因素对絮凝率的影响程度。从表2中可知：各个正交实验组合下的絮凝率都有一定的差异；而从值来看，可得知四个因素对纺锤芽孢杆菌产絮凝剂的影响大小次序为：温度＞接种量＞培养时间＞pH，因此，温度对纺锤芽孢杆菌产絮凝剂的影响起主导地位，接种量次之。根据K值的大小可以得知，正交所得出的最优培养条件组合方式为：3312，即温度为33℃、培养时间为54h、pH为5、接种量为6%。2.6初始培养基与优化培养基的效果比较如表3所示，分别测定在两种培养基条件下纺锤芽孢杆菌的絮凝率和最终的絮凝剂产量，发现其絮凝率从46.9%提高到了62.1%，增幅达32.4%，絮凝剂产量从0.372g/L提高到0.436g/L，增幅达17.2%。可以看出，在各种培养条件优化下，絮凝率有一定的提高。3结论（1）采用单因素实验，确定了纺锤芽孢杆菌产絮凝剂的最适温度、接种量、pH和培养时间，最适温度为31℃，最适接种量为6%，最适pH为5和6，最适培养时间为48h。（2）采用L9(34)正交实验，得到培养条件最佳组合为：温度为33℃，接种量为6%、pH为5、培养时间为54h。（3）优化前与优化后的比较：在培养条件优化下制得微生物絮凝剂的絮凝活性从46.9%提高到了62.1%，增长幅度为32.4%；微生物絮凝剂产量从0.372g/L提高到0.436g/L，增长幅度为17.2%。通过对纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂的培养条件进行优化，为该纺锤芽孢杆菌产微生物絮凝剂在制革废水方面的处理应用提供了参考。参考文献：[1]尹倩婷，王刚，张路路，等.牛鞋面革制造中浸灰与铬鞣废水循环利用研究[J].皮革科学与工程，2016，26（1）：43-49.[2]陈南南，孙静，张安龙.制革废水处理工艺的特点及其研究发展方向[J].污染防治技术，2009，22（1）：56-62.[3]丁绍兰，雷小利，李玲.制革废水氨氮处理技术研究进展[J].皮革科学与工程，2010，20（1）：26-28.[4]MorioMiyahara,AkihiroSakamoto,AtsushiKouzuma,etal.Polyironsulfateflocculantasaneffectiveadditiveforim-provingtheperformanceofmicrobialfuelcells[J].Biore-sourceTechnology,2016,221:331-335.[5]GkotsisPK,BatsariEL,PelekaEN,etal.Foulingcontrolinalab-scaleMBRsystem:Comparisonofseveralcommer-ciallyappliedcoagulants[J].JournalofEnvironmentalMan-agement,2017,203(2):838-846.[6]刘兴洁，张光华.有机/无机高分子絮凝剂在制革废水处理中的应用综述[J].中国皮革，2005，34（1）：19-21.[7]RongHongyan,GaoBaoyu,LiRuihua,etal.EffectofdosemethodsofasyntheticorganicpolymerandPFConflocpropertiesindyeingwastewatercoagulationprocess[J].ChemicalEngineeringJournal,2014,243:169-175.[8]王小琴，李日强，王爱英，等.微生物絮凝剂与化学絮凝剂的复配研究[J].山西农业科学，2017，45（3）：438-442.[9]彭晓文，邱廷省，陈明.微生物絮凝剂的絮凝特性及废水处理研究[J].皮革科学与工程，2004，14（1）：43-46.[10]郭帅.微生物絮凝剂的研制及其对染料和重金属废水的处理研究[D].湖南大学，2008.[11]孙莹，季方，周维军，等.Biolog微生物自动鉴定系统对2株大曲菌种的鉴定[J].酿酒，2013，40（3）：69-71.[12]罗平，杨林玉，卫宏毅.微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养条件优化[J].工业用水与废水，2017，48（1）：50-55.[13]杜璇，李斌.高效絮凝剂产生菌的培养和筛选[J].生物技术世界，2013，（3）：43-44.[14]李勇如.微生物絮凝剂产生菌的筛选及絮凝性能研究[D].北京工商大学，2012.[15]杨劲峰.成团泛菌产微生物絮凝剂处理石料废水的研究[J].河北化工，2013，36（2）：60-62.[16]姜琳琳.利用污泥残渣制备微生物絮凝剂的研究[D].大连理工大学，2009.