核糖体rDNA?ITS序列分析

近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来检测真核生物的方法已越来越被广泛应用。rDNA内转录间隔区（ITS）作为一种遗传标记（遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性，具有可遗传性和可识别性。生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记），已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定、中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、动物种系发生、遗传多样性与亲缘关系、病原诊断、系统发育研究等不同方面的研究。

菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，使传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中得到应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。

核糖体rDNA的结构及其特点

核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，执行着蛋白质合成的功能，它由几十种蛋白质和rRNA组成。编码rRNA的rDNA是基因组DNA中的中等重复、并有转录活性的基因家族 (genefamily)。

rDNA一般由转录区和非转录区(Non Transcribed Sequence，NTS)构成。

转录区包括5S、5.8S、18S和28SrDNA，其中18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，产生一个前体RNA。

内转录间隔区ITS(internal transcribed space)，位于18S和5.8S rDNA(ITS1)之间以及5．8S和28SrDNA之间(ITS2)，ITS1和ITS2常被合称为ITS,并且5.8 SRNA基因也被包括在ITS之内。

在18S rDNA基因上游和28S rDNA基因下游还有外转录间隔区

ETS(external transcribledspace)。

ITS和ETS区的转录物均在rRNA成熟过程中被降解。ITS和ETS包含有rDNA前体加工的信息，在 rRNA成熟过程中有着相当重要的作用。

非转录区又称基因间隔区IGS(intergenic spacer)，它将相邻的两个重复单位隔开，在转录时有启动和识别作用。

整个rDNA基因簇从5'到3'端依次为基因间隔区IGS(包括在18S rDNA基因上游的ETSl和在28SrDNA基因下游的ETS2)；位置可变的5SrDNA基因；18S rDNA基因；ITSl序列；5.8S rDNA基因；ITS2序列，以及28S rDNA基因。

ITS序列分析——种类鉴定及系统进化研究的好方法

18S、5．8S、28S rDNA基因序列进化缓慢而相对保守，但这三个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速，因而rDNA序列广泛用于菌物各级水平的系统学研究。

18S rDNA和28S rDNA分别约为1.8lb和3.4kb，序列中既有保守区又有可变区，在进化速率上比较保守，其中18S比28S基因更保守，是在系统发育中种级以上阶元的良好标记。

5.8S基因分子量小且高度保守，较少用于系统学研究。但它为真菌rDNA PCR扩增的通用引物的设计提供了极大的方便。

由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度为1000bp到小于300 bp大小不等，真菌ITS区域长度一般在650~750 bp(碱基对)。人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究。

ITS1和ITS2是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这种特点使ITS适合于菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。

由于ITS的序列分析能实质地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，此外ITS序列片段较小，易于分析，目前已被广泛应用于真菌

属内不同间或近似属间的系统发育研究中。

ITS序列分析的方法学

rDNA ITS序列分析通常通过多聚酶链式反应(PCR)技术实现，根据rDNA基因上高度保守区段设计出通用引物,借助PCR技术扩增rDNA的目的片段。

PCR技术与直接测序法相结合有很大的优越性：只需少量的DNA,每次扩增只需约0. 1~10 ng；可对DNA的2条链测序,从而减少错误；可利用总DNA的较粗制备品；适合于自动测序仪进行测序。

决定PCR技术应用效果的主要因素在于所选择的扩增区域变异是否适当,所以首先要选择合适的引物。

White等为真菌rRNA基因的ITS设计了3对特异引物,即ITS1、ITS4、ITS5,可用于大多数担子菌和子囊菌。这些引物也能扩增一些植物ITS区域。

ITS1-F和ITS4-B是Gardes等为真菌和担子菌分别设计的特异引物 ，能明显提高特异性。

Marmeisse等还为外生菌根粘花茹属(Hebeloma)的真菌及菌株鉴定设计并合成了特异引物。Kamel通过比较镰刀菌ITS区域序列而设计的镰刀菌特异引物对镰刀菌有着良好的特异性。

引物ITS1和ITS2用于扩增18 S rDNA和5.8 S rDNA之间的转录间隔区ITS1，引物ITS3和ITS4用于扩增5.8 S rDNA和28 S rDNA之间的转录间隔区ITS2。

每一个种或亚种只有一个ITS序列。这可以作为该菌种的特征序列。

分类鉴定必须借助于详细的序列对比，分析被试菌种与基因序列库中已知菌种的同源性（杨红等对尖孢镰刀菌异核体及其同核型分离菌株的ITS区进行测序分析，结果表明其碱基组成完全相同，属内种间的同源性在34%～99%之间，种内同源性在98%以上。ITS区不适合尖孢镰刀菌种内或种以下水平的分类鉴定）。

通常ITS的扩增产物是多种片段的混合物，可以通过克隆实现分离，然后对每一个克隆都测序，也可以通过电泳分离获得所需长度的

条带，胶回收后直接测序。

如果选择的引物将18 S和ITS一起扩增，那可以分析18 S序列在较高级别上确定样品的归属，然后通分析ITS序列将样品归类到种甚至亚种。

rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用前景

rRNA基因内转录间隔区作为一种遗传分子标记，与形态标记、细胞学标记和生化标记相比，具有明显的优越性。具体表现为：①该区域受外界环境影响较小，所受选择压力小，进化速度快，在物种间表现出极为广泛的序列多态性；②rDNA-ITS核苷酸序列长度适中，含足够量的遗传信息；③rDNA的ITS区在核基因组内是中等重复的，并且这种重复序列高度相似或一致化，为PCR产物直接测序提供了可能；④能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行扩增比较；⑤此技术快速、灵敏、准确。这些优点奠定了rRNA基因内转录间隔区具有广泛应用性的基础。rRNA基因内转录间隔区将在菌种分类鉴定、植物性中药材鉴定、物种亲缘关系及系统发育关系研究、动物种系发生、植物种质资源鉴定等方面将具有更为广阔的应用前景。