２０１１年９月 热带农业科学 第３１卷第９期 Ｓｅｐ．２０１１ ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＴＲＯＰＩＣＡＬ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．９ 利用ＳＲＡＰ技术分析海南野生兰属 植物的亲缘关系① 杨光穗②任 羽 王荣香 （中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所／ 农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室 海南儋州５７１７３７） 摘 要 利用ＳＲＡＰ分子标记技术对８种海南野生兰属植物的遗传多样性和亲缘关系进行分析。结果显示：从 ３０对引物中筛选出２０对ＳＲＡＰ引物组合．共扩增出１９５条多态性条带．平均每个引物组合产生９．７５个多态性 条带。ＵＰＧＭＡ聚类分析可将８种供试材料划分为４类：第１类为冬凤兰：第１Ｉ类为纹瓣兰：第１ＩＩ类为多花兰和 独占春；第Ⅳ类为寒兰、建兰、墨兰和兔耳兰，这与传统的形态分类学结果基本一致。本研究可为兰属品种的 鉴定和系统分类研究提供依据 关键词 兰属：ＳＲＡＰ；聚类分析：亲缘关系 分类号￥６８２．３１ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ Ｗｉｌｄ Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ ＳＲＡＰ ＹＡＮＧ Ｇｕａｎｇｓｕｉ ＲＥＮ Ｙｕ ＷＡＮＧ Ｒｏｎｇｘｉａｎｇ （Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＣＡＴＡＳ，Ｄａｎｚｈｏｕ，Ｈａｉｎａｎ ５７ １７３７） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＳＲＡＰ）ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ａｍｏｎｇ ８ ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ １ ９５ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ２０ ＳＲＡＰ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３０ ｏｎｅｓ． ９．７５ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ａｖｅｒａｇｅ．ＵＰＧＭＡ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｈｔａｔ ｔｈｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＲＡＰ ｍａｒｋｅｒ，ｃｌｕｓｔｅｒ １ ｗａｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｔ Ｃ．ｄａｙａｎｕｍ；ｃｌｕｓｔｅｒ ＩＩ ｉｎｃｌｕｄｅｄ Ｃ．ａｌｏｉｆｏｌｉｕｍ；ｃｌｕｓｔｅｒ ＩＩ１ ｗａｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ Ｃ．ｆｌｏｒｉｂｕｎｄｕｒｎ ａｎｄ Ｃ． ｅｂｕｒｎｅｕｍ，Ｃ ｋａｎｒａｎ，Ｃ．ｅ ｉｆｏｌｉｕｍ，ｅ￥ｉｎｅＲ，￣ｅ ａｎｄ ｃ．１ａｎｃｉｆｏｌｉｕｍ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｃｌｕｓｔｅｒ ＩＶ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｕｌｄ ｏｆｆｅｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ；ＳＲＡＰ；ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ 兰属（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ）植物在全世界约有４８种．其 大．正确处理其分类问题具有重要的经济意义。近 中中国有２９种 ．海南有１０种［ 我国兰属植物 年来．陆续有学者从细胞学标记＿３ 、同工酶技术『５ 被称为国兰或中国兰．大部分具有很高的观赏价值 和ＲＡＰＤ标记 等方面分析兰属植物中不同种或不 及经济价值 由于自然杂交的结果，兰属植物变异 同品种间的亲缘关系．并取得了一些成果 但利用 性很高．中间类型较多，种的界限不明确。给花卉 ＳＲＡＰ技术分析兰属植物遗传多样性的研究尚未见 品种的整理和研究带来一定的困难 报道 本文运用ＳＲＡＰ技术研究８种海南野生兰属 在我国．国兰拥有众多的爱好者．贸易额极 植物的遗传多样性．构建亲缘关系指纹图谱．为今 ①基金项目：林业科技推广项目“海南野生兰花资源开发及高效利用技术示范推广”：海南省自然科学基金项目（Ｎｏ ３０８２４）；中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（Ｎｏ．ＰＺＳ０６７）。 收稿日期：２０１卜ｏ３—０１；责任编辑／黄东杰；编辑部Ｅ－ｍａｉ１：ｒｄｎｋ￣１６３．ｃｏｍ。 ②杨光穗（１９７２～），女，硕士，副研究员，研究方向为热带花卉资源及栽培生理。 一 １ 一 ２０１１年９月 热带农业科学 第３１卷第９期 后兰属植物的分类、育种及杂交亲本的选择提供了 分子水平上的参考。 １材料与方法 １．１ 材料 试验所用的８种野生兰属植物材料分别收集于 海南省尖峰岭、黎母山、坝王岭等山区中，保存于 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带 兰种质圃。材料信息见表１ 表１供试材料及来源 １．２ 方法 １．２．１ ＤＮＡ的提取 采集新鲜兰属植物幼嫩叶片０．２ ｇ．提取基因 组ＤＮＡ．其提取方法参照顾红雅等 的方法．并做 了相应改进。调节ＤＮＡ浓度为１０ ｎｇ／ｌ￣Ｌ １．２．２ ＳＲＡＰ分析 反应总体积为２５ ，其中模板１００ｎｇ， 酶 １．５ Ｕ，Ｍｇｃｌ ２ １．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，引物１．５×１０一ｍｍｏｌ／Ｌ． ｄＮＴＰｓ ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ，１０×ｂｕｆｆｅｒ ２．５ Ｌ。扩增程序 为：９４℃预变性５ ｍｉｎ；９４℃变性１ ｍｉｎ．３５℃复性 ｌｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，５个循环；９４℃变性１ｍｉｎ， ５０￣Ｃ复性１ ｍｉｎ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环：最 后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。取ＰＣＲ产物５ Ｌ于６｛６的聚丙 烯酰胺（７ｍｏｌ／Ｌ尿素）电泳分析。电泳缓冲液为１ ＸＴＢＥ 电泳时，用１４０Ｗ的功率预电泳３０ｍｉｎ．上样后用 同样的功率电泳２．５～３．０ ｈ，电泳后银染．具体操 作参照许绍斌等［９３的方法 １．２．３数据处理 根据ＰｅＲ扩增结果．每个样品的扩增带数按有 带赋值为１．无带赋值为０进行标记读带．不具多 态性的带不予考虑。建立１．０型数据。每２个品 ２ 一 种间的遗传相似系数用Ｎｅｉ等的公式计算：ＧＳ ＝ ２Ｎ ／（Ⅳ ＋Ⅳ 式中 指２品种共有的带数， ＋ Ⅳ 指２品种所有带数之和 利用ＭＶＳＰ３．１软件计 算相似系数．获得相似系数矩阵．用ＵＰＧＭＡ（Ｕｎ— ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅ．算术平均数 非加权成组法）进行聚类分析．并构建树状图 ２结果与分析 ２．１种间遗传多样性分析 在ＳＲＡＰ分析中．采用３０对引物组合对８种兰 属植株材料进行扩增．其中２０对引物组合可扩增 出清晰的多态性条带．共扩增出１９５条多态性带 （图１为引物ｍｅ３一ｅｍ４的扩增结果）．每对引物组合的多 态性条带数为３～２０条不等．平均每对引物组合产 生９．７５个多态性条带 图１ ８种兰属植物ＳＲＡＰ引物ｍｅ３一ｅｍ４的扩增 ２．２ 聚类分析 根据ＳＲＡＰ分析建立的１．０型数据．计算出成 对种间遗传相似系数为０．１６３～０．６５６ 以种间遗 传相似系数为基础．按ＵＰＧＭＡ法进行聚类分析并作 聚类图（图２） 利用ＳＲＡＰ标记进行聚类分析时． 在相似系数０．４２处可将参试种分为４类：第１类： 冬凤兰：第１Ｉ类：纹瓣兰：第１ＩＩ类：多花兰和独占 春；第Ⅳ类：寒兰、兔耳兰、墨兰和建兰。在此分析 中．多花兰与独占春的亲缘关系最近．建兰与寒兰的 亲缘关系较近．而冬凤兰与其它７种兰属植物的亲缘 关系最远．这与传统的形态学分类结果基本一致 ３讨论 兰属植物的分类主要以形态学特征为依据．德 杨光穗等 利用ＳＲＡＰ技术分析海南野生兰属植物的亲缘关系 ＵＰＧＭＡ ｆＮ 冬凤兰 ｌｌ一一 …一ｕ ～一一，…－一一～一，一…… 一一…一 …～一纹瓣兰 ｛ ； ～一… ，一一一－…一一 一一一一多花兰 ； ｛１ ’独占春 ｌｌｌ一一一……’…。一。 一…’ … … 一一 寒兰 ； ’一一１一＿＿～…一＇一一……～一…一１一～一一＿一…一一兔耳兰 ； ｒ一一 ～一一１—１＿一＿ … 一 墨兰 ｈ ， 建兰 一一…’一～ｒ～。 一 ’一一’ｒ 一。～。 一一Ｔ一’一～一一一 一１…一一…。… 一一 一一一一一一～一… Ｏ．Ｏ４ Ｏ．２ ０．３６ ０．５２ ０．６８ Ｏ．８４ １ Ｎｅｉ和Ｌｉ的相关系数 图２ ８种兰属植物的ＳＲＡＰ聚类分析图 国的形态分类学家施莱希特以及英国的分类学家 Ｐｕｙ和Ｃｒｉｂｂ将建兰、寒兰和墨兰划为建兰组＿１ ． 吴应祥｜１们将建兰、墨兰、寒兰和春剑等划为蕙组的 小花亚组，独占春等划分在大花亚组 《中国植物 志》第十八卷 把兰属分为３个亚属１０个组 一 般认为建兰、寒兰和墨兰的亲缘关系较近，而独占 春和兔耳兰与它们的亲缘关系较远 而本研究显 示．墨兰和建兰的亲缘关系最近．这与孙彩云等 ］ 的研究结果一致．与梁红健等口 人用同工酶和 ＲＡＰＤ标记均证实寒兰和建兰的亲缘关系最近不同： 从聚类图上看出．兔耳兰先与墨兰和建兰聚在一 起．而后与寒兰聚在一起．这表明兔耳兰与它们的 距离较近：陈心启 １ 将兔耳兰归于建兰亚属的兔耳 兰组．而吴应祥＿ｌ。。将兔耳兰定为一个独立的组 王 慧中等［”］用ＲＡＰＤ技术分析的结果表明．兔耳兰与大 花亚属材料属于同一组．但ＡＦＬＰ技术分析的结果则 表明，兔耳兰与建兰亚属并在同一组。张明永等［１４］ 分析了兰属２７个种、３个栽培品种的ＤＮＡ—ＩＴＳ区段 序列．其中对兔耳兰的分析结果与吴应祥的一致 本试验结果与王慧中的ＡＦＬＰ结果一致．即兔耳兰 与建兰亚属并在同一组。由此看来，兔耳兰的系统 分类定位还有待于采用更多样本做进一步验证 同 属于兰亚属的冬凤兰和纹瓣兰各聚为一类．它们在 兰亚属中分别属于带叶组和硬叶组：属于兰亚属多 花组的多花兰与属于大花亚属腋花组的独占春聚为 一类．而且二者表现出较近的亲缘关系．与传统的 形态分类存在差异 因此．二者的分类仍有待于形 态学与分子生物学水平的进一步研究 此外．ＳＲＡＰ聚类分析结果与形态学分类结果 基本一致．说明ＳＲＡＰ技术适用于兰属植物的系统 学及亲缘关系鉴定的研究。ＳＲＡＰ多态性从分子水 平上揭示了基因组的差异．这将为兰属植物的分 类、育种和杂交亲本的选择提供重要依据。 参考文献 ［１］Ｔｈｏｍａｓ Ｃ Ｍ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｓｔｒｉＣ— ｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｐｏ１ｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＡＦＬＰ）ｍａｒｋｅｒｓ ｔｉｇｈｔｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ｃｆ－９ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｃｌａｄｏｓｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９５，８ （５）：７８５—７９４． ［２］丁慎言，尹俊梅．海南岛野生兰花图鉴［Ｍ］．北京： 中 国农业出版社，２００５．１２：４２—５２． ［３］陈心启，刘仲健．兰属中若干分类群的订正［Ｊ］．植物 分类学报，２００３，４１（１）：７９—８４． ［４］李玉阁．郭卫红．吴伯骥．六种国产兰属植物的核型 研究［Ｊ］．云南植物研究，２００３，２５（１）：８３—８９． 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